ARN<em> In situ</emHybridation> en embryons entiers de montage et histologie Adapté pour les élasmobranches marins
Summary
En combinant les méthodes de montage ARN ensemble<em> In situ</emHybridation> et l'histologie, l'expression des gènes peuvent être liés aux décisions du destin cellulaire dans l'embryon en développement. Ces méthodes ont été adaptées aux élasmobranches marins et faciliter l'utilisation de ces animaux comme des organismes modèles pour les études biomédicales, la toxicologie et comparative.
Abstract
Élasmobranches marins sont évalués modèles animaux pour des études biomédicales et de la génomique car ils sont les vertébrés les plus primitifs pour avoir l'immunité adaptative et des mécanismes uniques pour l'osmorégulation 1-3. Comme les plus primitives de vie des vertébrés à mâchoire-avec des appendices paires, les élasmobranches sont un modèle évolutif important, en particulier pour les études de l'évolution et de développement. Élasmobranches marins ont également été utilisés pour étudier la toxicologie aquatique et la physiologie du stress en relation avec le changement climatique 4. Ainsi, le développement et l'adaptation des méthodes est nécessaire pour faciliter et étendre l'utilisation de ces vertébrés primitifs à de multiples disciplines biologiques. Ici, je présente l'adaptation réussie de l'ARN monture toute hybridation in situ et des techniques histologiques pour étudier l'expression des gènes et histologie chez les élasmobranches.
Suivi de l'expression des gènes est un outil caractéristique de biologie développementalegues, et il est largement utilisé pour étudier les processus de développement 5. ARN monture toute hybridation in situ permet la visualisation et la localisation des transcrits de gènes spécifiques dans les tissus de l'embryon en développement. Le modèle d'expression d'un message d'un gène peut donner un aperçu de ce que les processus de développement et les décisions du destin cellulaire un gène peut contrôler. En comparant le profil d'expression d'un gène à différents stades de développement, le gain de connaissance sur la façon dont le rôle d'un gène changements au cours du développement.
Alors que l'ensemble de montage in situ de l 'offre un moyen de localiser l'expression du gène des tissus, des techniques histologiques permettent l'identification des types de cellules différenciées et des tissus. Colorations histologiques ont des fonctions variées. Taches générales sont utilisées pour mettre en évidence la morphologie des cellules, par exemple l'hématoxyline et à l'éosine pour la coloration générale de noyaux et le cytoplasme, respectivement. D'autres taches peuvent mettre en évidence cellule spécifiquetypes. Par exemple, le bleu alcian tache rapportée dans cet article est une tache largement utilisé pour identifier mucosaccharides cationique. La coloration du tube digestif avec le bleu alcian peut identifier la répartition des cellules caliciformes qui produisent mucosaccharides. Les variations de constituants mucosaccharide sur les peptides courts distinguer les cellules caliciformes par fonction au sein de l'appareil digestif 6. À l'aide de l'ARN de montage ensemble des méthodes in situ d 'histochimique et en même temps, les décisions destin cellulaire peut être relié à l'expression spécifique du gène.
Bien que l'ARN in situ de l 'histochimie et sont largement utilisés par les chercheurs, leur adaptation et leur utilisation chez les élasmobranches marins ont rencontré un succès limité et varié. Ici, je présente protocoles élaborés pour les élasmobranches et utilisé sur une base régulière dans mon laboratoire. Même si une nouvelle modification de l'ARN dans la méthode d'hybridation in situ 's peut être nécessaire pour s'adapter aux différentes espèces, les protocoles décrits ici pournir un bon point de départ pour les chercheurs désireux d'adapter l'utilisation des élasmobranches marins à leurs recherches scientifiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les protocoles présentés sont des méthodes classiques de suivi de l'expression des gènes et d'identifier les types de cellules différenciées, et ont été adaptés pour une utilisation chez les élasmobranches marins. D'autres modifications de ces protocoles peut être nécessaire pour s'adapter à différentes espèces d'élasmobranches.
La plus grande préoccupation concernant l'ensemble de montage ARN in situ de l 'est le risque de contamination …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Je tiens à remercier les nombreux étudiants de premier cycle qui ont travaillé dans mon laboratoire et a contribué à l'évolution de ces protocoles. NAT a reçu le soutien du Réseau Skidmore-Union, un projet mis en place avec une avance NSF PAYÉ subvention.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 10 x transcription buffer | Roche | 11-465-384-001 | |
| DIG-RNA labeling mix | Roche | 11-277-073-910 | |
| RNAse inhibitor | Roche | 03-335-399-001 | |
| RNA polymerase – SP6 | Roche | 10-810-274-001 | |
| DNAseI, RNAse-free | Roche | 10-776-785-001 | |
| Yeast RNA | Invitrogen | 15401-029 | |
| CHAPS | EMD-Millipore | 220201 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | H4784 | |
| DEPC (diethyl pyrocarbonate) | Research Organics | 2106D | |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | |
| Netwell inserts | Electron Microscopy Sciences | 64713-00 | Netwells for use in 6-well tissue culture dishes |
| 6-well tissue culture plate | Corning | 3516 | |
| Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
| formamide | Fisher | BP227500 | |
| Proteinase K | Invitrogen | 59895 (AM2542) | |
| NBT | 11585029001 | ||
| BCIP | Roche | 11585002001 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | EMD | HX0635-1 | |
| Sheep serum | VWR | 101301-478 | |
| glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| tRNA | Roche | 10-109-541-001 | |
| Anti-DIG Fab Fragments | Roche | 1137-6623 | |
| Table 3. Reagents and equipment for RNA whole mount in situ‘s. | |||
| 1% Alcian Blue 8GS, pH 2.5 | Electron Microscopy Sciences | 26323-01 | |
| Nuclear Fast Red | Electron Microscopy Sciences | 26078-05 | |
| DPX Mountant | Electron Microscopy Sciences | 13510 | |
| Paraffin (Paraplast X-tra) | McCormick Scientific | 39503002 | |
| 10% Formalin, NBF | VWR | 95042-908 | |
| Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
| Stainless steal base molds | Tissue-Tek | 4161-4165 | Multiple sizes available. |
| Cassettes | Tissue-Tek | 4170 | |
| Slide warmer | Fisher-Scientific | 12-594Q | |
| Tissue Embedder | Leica Microsystems | EG1160 | |
| Microtome, rotary | Leica Microsystems | RM2235 | |
| Tissue-Tek Slide Staining Set | Electron Microscopy Sciences | 62540-01 | |
| Tissue-Tek 24-Slide Holder | Electron Microscopy Sciences | 62543-06 | |
| Superfrost*Plus slides | Fisherbrand | 12-550-17 | |
| Table 4. Reagents and equipment for Alcian Blue stain. |
References
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