RNA<em> In situ</emIbridazione> in embrioni Mount interi e istologia Adattato per Elasmobranchi Marine
Summary
Grazie alla combinazione di metodi di montaggio RNA tutto<em> In situ</emIbridazione> e istologia, l'espressione genica può essere collegato con le decisioni destino delle cellule nell'embrione in via di sviluppo. Questi metodi sono stati adattati per gli Elasmobranchi marine e facilitare l'uso di questi animali come organismi modello per biomedico, tossicologia e studi comparativi.
Abstract
Elasmobranchi Marine sono valutati modelli animali per studi biomedici e genomica in quanto sono i vertebrati più primitivi di avere l'immunità adattativa e hanno meccanismi unici per osmoregolazione 1-3. Come le più primitive di vita ganasce-vertebrati con appendici appaiate, elasmobranchi sono un modello evolutivamente importante, soprattutto per gli studi in evoluzione e sviluppo. Elasmobranchi marini sono stati utilizzati anche per studiare tossicologia acquatica e fisiologia dello stress in relazione a 4 dei cambiamenti climatici. Pertanto, lo sviluppo e l'adeguamento delle metodologie è necessario per agevolare ed estendere l'uso di questi vertebrati primitivi a più discipline biologiche. Qui presento l'adattamento di successo del monte RNA tutto ibridazione in situ e tecniche istologiche per lo studio dell'espressione genica e cellulare in istologia elasmobranchi.
Controllo dell'espressione genica è uno strumento di sviluppo segno distintivo di biologists, ed è ampiamente utilizzato per studiare i processi di sviluppo 5. Mount RNA tutto ibridazione in situ permette la visualizzazione e la localizzazione di trascritti del gene specifici nei tessuti dell'embrione in via di sviluppo. Il pattern di espressione del messaggio di un gene in grado di fornire indicazioni su ciò che i processi di sviluppo e le decisioni sul destino delle cellule un gene può controllare. Confrontando il pattern di espressione di un gene in differenti stadi di sviluppo, intuizione può essere ottenuto in quanto il ruolo di un gene cambia durante lo sviluppo.
Mentre mount intero in situ 's fornisce un mezzo per localizzare l'espressione genica di tessuti, tecniche istologiche consentire l'identificazione di tipi di cellule differenziate e tessuti. Macchie istologiche hanno funzioni diverse. Macchie generale sono utilizzati per evidenziare la morfologia cellulare, ad esempio ematossilina ed eosina generale per la colorazione dei nuclei e citoplasma, rispettivamente. Altre colorazioni può evidenziare cella specificatipi. Per esempio, il blu Alcian macchia riportati in questo documento è una macchia ampiamente utilizzato per identificare mucosaccharides cationico. Colorazione del tubo digerente con Alcian blue possibile identificare la distribuzione di cellule caliciformi che producono mucosaccharides. Le variazioni intervenute nel perimetro mucosaccharide su brevi peptidi distinguere le cellule caliciformi per funzione all'interno del tubo digerente 6. Utilizzando mount intero RNA in situ metodi 's istochimiche e contemporaneamente, decisioni destino cellulare può essere collegato al gene-specifico espressione.
Anche se RNA in situ 's e istochimica sono ampiamente utilizzati dai ricercatori, il loro adattamento e l'uso in elasmobranchi marini hanno incontrato un successo limitato e varia. Qui presento i protocolli sviluppati per elasmobranchi e utilizzato su base regolare nel mio laboratorio. Sebbene ulteriore modifica delle RNA ibridazione in situ metodo 's può essere necessaria per adattarsi a diverse specie, i protocolli descritti qui provide un punto di forza di partenza per i ricercatori che desiderano adattare l'uso di elasmobranchi marini alle loro domande scientifiche.
Protocol
Representative Results
Discussion
I protocolli presentati sono i metodi classici per monitorare l'espressione genica e di individuare i tipi di cellule differenziate, ed è stato adattato per l'uso in elasmobranchi marini. Ulteriori modifiche di questi protocolli possono essere necessarie per adattarsi alle diverse specie di elasmobranchi.
Il problema più comune relativa montatura intera RNA in situ 's è il rischio di contaminazione RNasi e quindi la degradazione della sonda RNA e messaggi endogeni. Du…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Desidero ringraziare i molti studenti universitari che hanno lavorato nel mio laboratorio e ha contribuito all'evoluzione di questi protocolli. NAT ha ricevuto il sostegno del Skidmore-Union Network, un progetto stabilito con un ANTICIPO PAGATO NSF sovvenzione.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 10 x transcription buffer | Roche | 11-465-384-001 | |
| DIG-RNA labeling mix | Roche | 11-277-073-910 | |
| RNAse inhibitor | Roche | 03-335-399-001 | |
| RNA polymerase – SP6 | Roche | 10-810-274-001 | |
| DNAseI, RNAse-free | Roche | 10-776-785-001 | |
| Yeast RNA | Invitrogen | 15401-029 | |
| CHAPS | EMD-Millipore | 220201 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | H4784 | |
| DEPC (diethyl pyrocarbonate) | Research Organics | 2106D | |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | |
| Netwell inserts | Electron Microscopy Sciences | 64713-00 | Netwells for use in 6-well tissue culture dishes |
| 6-well tissue culture plate | Corning | 3516 | |
| Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
| formamide | Fisher | BP227500 | |
| Proteinase K | Invitrogen | 59895 (AM2542) | |
| NBT | 11585029001 | ||
| BCIP | Roche | 11585002001 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | EMD | HX0635-1 | |
| Sheep serum | VWR | 101301-478 | |
| glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| tRNA | Roche | 10-109-541-001 | |
| Anti-DIG Fab Fragments | Roche | 1137-6623 | |
| Table 3. Reagents and equipment for RNA whole mount in situ‘s. | |||
| 1% Alcian Blue 8GS, pH 2.5 | Electron Microscopy Sciences | 26323-01 | |
| Nuclear Fast Red | Electron Microscopy Sciences | 26078-05 | |
| DPX Mountant | Electron Microscopy Sciences | 13510 | |
| Paraffin (Paraplast X-tra) | McCormick Scientific | 39503002 | |
| 10% Formalin, NBF | VWR | 95042-908 | |
| Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
| Stainless steal base molds | Tissue-Tek | 4161-4165 | Multiple sizes available. |
| Cassettes | Tissue-Tek | 4170 | |
| Slide warmer | Fisher-Scientific | 12-594Q | |
| Tissue Embedder | Leica Microsystems | EG1160 | |
| Microtome, rotary | Leica Microsystems | RM2235 | |
| Tissue-Tek Slide Staining Set | Electron Microscopy Sciences | 62540-01 | |
| Tissue-Tek 24-Slide Holder | Electron Microscopy Sciences | 62543-06 | |
| Superfrost*Plus slides | Fisherbrand | 12-550-17 | |
| Table 4. Reagents and equipment for Alcian Blue stain. |
References
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