RNA<em> I situ</em> Hybridisering i Whole Mount embryoer og cellehistologi Tilrettelagt for Marine Elasmobranchs
Summary
Ved å kombinere metoder for RNA hele mount<em> In situ</em> Hybridisering og histologi, kan genuttrykk ha sammenheng med celle skjebne beslutninger i utvikling av embryo. Disse metodene er tilpasset marine elasmobranchs og lette bruken av disse dyrene som modellorganismer for biomedisinsk, toksikologi og komparative studier.
Abstract
Marine elasmobranchs verdsettes dyremodeller for biomedisinsk og genomisk studier som de er de mest primitive virveldyr å ha adaptiv immunitet og har unike mekanismer for osmoregulering 1-3. Som den mest primitive levende jawed-virveldyr med sammenkoblede vedheng, elasmobranchs er en evolusjonært viktig modell, spesielt for studier i evolusjon og utvikling. Marine elasmobranchs har også blitt brukt til å studere akvatisk toksikologi og stressfysiologi i forhold til klimaendringer 4. Således er utviklingen og tilpasning av metoder for å forenkle og utvide bruken av disse primitive virveldyr til flere biologiske disipliner. Her har jeg samlet en vellykket tilpasning av RNA hele mount in situ hybridisering og histologiske teknikker for å studere genuttrykk og cellehistologi i elasmobranchs.
Overvåking genuttrykk er et kjennetegn verktøy for utvikling Biologists, og er mye brukt til å undersøke utviklingsprosesser 5. RNA hele mount in situ hybridisering åpner for visualisering og lokalisering av spesifikke gen transkripsjoner i vev i utvikling av embryo. Uttrykket mønster av et gen budskap kan gi innsikt i hva utviklingsprosesser og celle skjebne beslutninger et gen kan styre. Ved å sammenligne ekspresjon mønster av et gen på forskjellige utviklingsstadier, kan innsikt oppnås i hvordan rollen av et gen forandringer under utvikling.
Mens hele mount in situ 's gir et middel for å lokalisere genekspresjon til vev, histologiske teknikker tillater for identifisering av differensierte celletyper og vev. Histologiske flekker har varierte funksjoner. Generelle flekker fremheves cellemorfologi, f.eks hematoxylin og eosin for generell farging av kjerner og cytoplasma, henholdsvis. Andre flekker kan markere bestemt celletyper. For eksempel flekken Alcian blå rapportert i denne artikkelen er en mye brukt kationisk flekken for å identifisere mucosaccharides. Farging av fordøyelseskanalen med Alcian blå kan identifisere fordelingen av goblet celler som produserer mucosaccharides. Variasjoner i mucosaccharide bestanddeler på korte peptider skille goblet celler etter funksjon innenfor fordøyelseskanalen 6. Ved å bruke RNA hele mount in situ 's og histochemical metoder samtidig, kan celle skjebne beslutninger knyttet til gen-spesifikk uttrykk.
Selv RNA in situ 's og histochemistry er mye brukt av forskere, har deres tilpasning og bruk i marine elasmobranchs møtte begrenset og variert suksess. Her har jeg samlet protokoller utviklet for elasmobranchs og brukes på en jevnlig basis i laboratoriet mitt. Selv ytterligere modifikasjon av RNA in situ 's hybridisering fremgangsmåte kan være nødvendig for å tilpasse seg til forskjellige arter, beskrev protokollene her provide et sterkt utgangspunkt for forskere som ønsker å tilpasse bruk av marine elasmobranchs til sine vitenskapelige undersøkelser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollene som presenteres er klassiske metoder for overvåking genuttrykk og identifisere differensierte celletyper, og er tilrettelagt for bruk i marine elasmobranchs. Ytterligere modifikasjoner av disse protokollene kan være nødvendig å tilpasse seg ulike elasmobranch arter.
Den vanligste bekymring RNA hel mount in situ 's er risikoen for RNase kontaminering og derved nedbrytning av RNA-probe og endogene meldinger. To aspekter må tas i betraktning: syntese av riboprobe …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Jeg ønsker å takke de mange studentene som har jobbet i laboratoriet mitt og bidratt til utviklingen av disse protokollene. NAT har fått støtte fra Skidmore-Union Network, et prosjekt etablert med NSF forhånd betalt tilskudd.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 10 x transcription buffer | Roche | 11-465-384-001 | |
| DIG-RNA labeling mix | Roche | 11-277-073-910 | |
| RNAse inhibitor | Roche | 03-335-399-001 | |
| RNA polymerase – SP6 | Roche | 10-810-274-001 | |
| DNAseI, RNAse-free | Roche | 10-776-785-001 | |
| Yeast RNA | Invitrogen | 15401-029 | |
| CHAPS | EMD-Millipore | 220201 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | H4784 | |
| DEPC (diethyl pyrocarbonate) | Research Organics | 2106D | |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | |
| Netwell inserts | Electron Microscopy Sciences | 64713-00 | Netwells for use in 6-well tissue culture dishes |
| 6-well tissue culture plate | Corning | 3516 | |
| Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
| formamide | Fisher | BP227500 | |
| Proteinase K | Invitrogen | 59895 (AM2542) | |
| NBT | 11585029001 | ||
| BCIP | Roche | 11585002001 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | EMD | HX0635-1 | |
| Sheep serum | VWR | 101301-478 | |
| glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| tRNA | Roche | 10-109-541-001 | |
| Anti-DIG Fab Fragments | Roche | 1137-6623 | |
| Table 3. Reagents and equipment for RNA whole mount in situ‘s. | |||
| 1% Alcian Blue 8GS, pH 2.5 | Electron Microscopy Sciences | 26323-01 | |
| Nuclear Fast Red | Electron Microscopy Sciences | 26078-05 | |
| DPX Mountant | Electron Microscopy Sciences | 13510 | |
| Paraffin (Paraplast X-tra) | McCormick Scientific | 39503002 | |
| 10% Formalin, NBF | VWR | 95042-908 | |
| Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
| Stainless steal base molds | Tissue-Tek | 4161-4165 | Multiple sizes available. |
| Cassettes | Tissue-Tek | 4170 | |
| Slide warmer | Fisher-Scientific | 12-594Q | |
| Tissue Embedder | Leica Microsystems | EG1160 | |
| Microtome, rotary | Leica Microsystems | RM2235 | |
| Tissue-Tek Slide Staining Set | Electron Microscopy Sciences | 62540-01 | |
| Tissue-Tek 24-Slide Holder | Electron Microscopy Sciences | 62543-06 | |
| Superfrost*Plus slides | Fisherbrand | 12-550-17 | |
| Table 4. Reagents and equipment for Alcian Blue stain. |
References
- Forester, R., Goldstein, L. Intracellular osmoregulatory role of amino acids and urea in marine elasmobranchs. Am. J. Physiol. 230, 925-931 (1976).
- Shuttleworth, T., Shuttleworth, R. . Physiology of elasmobranch fishes. , 171-194 (1988).
- Yancey, P. H., Clark, M. E., Hand, S. C., Bowlus, R. D., Somero, G. N. Living with water stress: evolution of osmolyte systems. Science. 217, 1214-1222 (1982).
- Ballatori, N., Villalobos, A. Defining the molecular and cellular basis of toxicity using comparative models. Toxicl. Appl. Pharmacol. 183, 207-220 (2002).
- Nieto, M. A., Patel, K., Wilkinson, D. G. In situ hybridization analysis of chick embryos in whole mount and tissue sections. Methods Cell Biol. 51, 219-235 (1996).
- Jass, J. R., Walsh, M. D. Altered mucin expression in the gastrointestinal tract: a review. J Cell Mol Med. 5, 327-351 (2001).
- Ballard, W. W., Mellinger, J., Lechenault, H. A series of normal stages for development of Scyliorhinus canicula, the lesser spotted dogfish (Chondrichthyes; Scyliorhinidae). J. Exp. Zool. 267, 318-336 (1993).
- Echelard, Y., et al. Sonic hedgehog, a member of a family of putative signaling molecules, is implicated in the regulation of CNS polarity. Cell. 75, 1417-1430 (1993).
- Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell. 75, 1401-1416 (1993).
- Theodosiou, N. A., Hall, D. A., Jowdry, A. L. Comparison of acid mucin goblet cell distribution and Hox13 expression patterns in the developing vertebrate digestive tract. J. Exp. Zool. B. Mol. Dev. Evol. 308, 442-453 (2007).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Ch. 7. Molecular Cloning; A Laboratory Manual. 1, 7.82 (2001).
- Zhang, G., Miyamoto, M. M., Cohn, M. J. Lamprey type II collagen and Sox9 reveal an ancient origin of the vertebrate collagenous skeleton. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3180-3185 (2006).
- Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. . Theory and practice of histotechnology. , (1980).
- Theodosiou, N. A., Simeone, A. Evidence of a rudimentary colon in the elasmobranch, Leucoraja erinacea. Dev. Genes Evol. 222, 237-243 (2012).
- Filipe, M. I. Mucins in the human gastrointestinal epithelium: a review. Invest. Cell Pathol. 2, 195-216 (1979).
- Corfield, A. P., Wagner, S. A., Clamp, J. R., Kriaris, M. S., Hoskins, L. C. Mucin degradation in the human colon: production of sialidase, sialate O-acetylesterase, N-acetylneuraminate lyase, arylesterase, and glycosulfatase activities by strains of fecal bacteria. Infect. Immun. 60, 3971-3978 (1992).
- Reid, B. J., et al. Flow-cytometric and histological progression to malignancy in Barrett’s esophagus: prospective endoscopic surveillance of a cohort. Gastroenterology. 102, 1212-1219 (1992).
- Mowry, R. Selective staining of pancreatic beta-cell granules. Evolution and present status. Arch. Pathol. Lab Med. 107, 464-468 (1983).
- Roberts, D. J., Smith, D. M., Goff, D. J., Tabin, C. J. Epithelial-mesenchymal signaling during the regionalization of the chick gut. Development. 125, 2791-2801 (1998).
