Cromosoma Preparación de las células cultivadas
Summary
Los cromosomas se pueden aislar de las células vivas, tales como linfocitos o fibroblastos de la piel, y a partir de organismos, incluyendo seres humanos o ratones. Estas preparaciones cromosómicas se pueden utilizar más de rutina bandeo G y procedimientos citogenéticos moleculares como la hibridación fluorescente in situ (FISH), la hibridación genómica comparada (CGH) y cariotipo espectral (SKY).
Abstract
Cromosoma (citogenética) análisis se utiliza ampliamente para la detección de la inestabilidad cromosómica. Cuando se sigue por bandeo G y las técnicas moleculares como la hibridación in situ fluorescente (FISH), este ensayo tiene la extraordinaria capacidad de analizar las células individuales de las aberraciones que implican ganancias o pérdidas de partes del genoma y reordenamientos que afecte a uno o más cromosomas. En los seres humanos, las anomalías cromosómicas ocurren en aproximadamente 1 de cada 160 nacidos vivos a 1,2, el 60-80% de todos los abortos involuntarios 3,4, 10% de los mortinatos 2,5, 13% de los individuos con enfermedad cardíaca congénita 6, 3-6% de los casos de infertilidad 2, y en muchos pacientes con retraso en el desarrollo y defectos de nacimiento 7. El análisis citogenético de malignidad se utiliza de forma rutinaria por los investigadores y los clínicos, ya que se ha demostrado que las observaciones de anomalías cromosómicas clonales tener tanto significado diagnóstico y pronóstico 8,9.60, el aislamiento del cromosoma tiene un valor incalculable para la terapia génica y la investigación con células madre de organismos incluyendo primates no humanos y roedores 10-13.
Los cromosomas se pueden aislar a partir de células de tejidos vivos, incluyendo linfocitos de sangre, fibroblastos de la piel, amniocitos, placenta, médula ósea, y las muestras de tumor. Los cromosomas son analizados en la etapa de metafase de la mitosis, cuando más se condensan y por lo tanto más claramente visible. El primer paso de la técnica cromosoma aislamiento implica la interrupción de las fibras del huso por incubación con Colcemid, para evitar que las células de proceder a la etapa de la anafase posterior. Las células se trataron luego con una solución hipotónica y se conservan en su estado hinchado con fijador de Carnoy. Las células son luego caer sobre portaobjetos y luego se pueden utilizar para una variedad de procedimientos. Bandeo G consiste en el tratamiento de tripsina seguido de tinción con Giemsa para crear la luz característica y bandas oscuras. Lo mismo procedure para aislar cromosomas se puede utilizar para la preparación de células para los procedimientos tales como la hibridación in situ fluorescente (FISH), hibridación genómica comparativa (CGH), y cariotipo espectral (SKY) 14,15.
Introduction
El análisis cromosómico es una técnica convencional utilizada en todo el mundo para el diagnóstico de la inestabilidad cromosómica y reordenamientos que conducen a trastornos genéticos y 1,2,8,9 malignidad. Además, una resolución más alta para el diagnóstico y la investigación de anomalías genéticas constitucionales y el cáncer adquirida se puede lograr con la combinación de los procedimientos citogenéticos clásicos y metodologías de citogenética molecular, tales como hibridación in situ fluorescente (FISH), hibridación genómica comparativa (CGH) y cariotipo espectral (SKY) 14,15. Más recientemente, estas técnicas se han utilizado para la evaluación de la inestabilidad cromosómica asociada con la investigación de células madre. Anomalías del cariotipo como aneuploidía de células a largo plazo cultivadas embrionarias (ES) y las células madre adultas de diversos organismos han sido reportados por varios laboratorios. Evidencia reciente apoya que algunas líneas celulares son inherentemente más inclinados al cromosoma instabilidad, independientemente de las condiciones de cultivo. Por esta razón, cuando el establecimiento y / o mantenimiento de líneas de células madre rhesus humanos, de ratón, o bien, se recomienda el análisis de cromosomas, como parte del proceso de control de calidad. Muchos informes describen el creciente interés en el uso de la citogenética de rutina y moleculares para vigilar la estabilidad cromosómica de las células madre y células malignas o varios organismos en cultivo 10-13. Estos protocolos son cada vez más utilizados por los laboratorios no genéticos para la evaluación cromosómica rápida de sus células cultivadas 13. Presentamos nuestros procedimientos básicos para la preparación de cromosomas de diversos tipos de células, que se pueden aplicar para ambos propósitos y células clínicos y de investigación derivadas de diversos organismos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos utilizado el presente procedimiento para el cromosoma aislamiento a partir de células de diversos organismos, incluyendo diversos tipos de células obtenidos a partir de humano, macacos Rhesus, ratas, y ratones 11,20-22. Se proporciona el protocolo estándar, pero ciertos pasos clave y variables puede ser necesario ajustar para estos diversos tipos de células. Varios pasos específicos son cruciales tanto en la preparación cromosómica y bandas G para asegurar la mejor calidad posible de los resultad…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Trabajo descrito en este manuscrito fue posible gracias al financiamiento de la Fundación Patrick F. Taylor.
Materials
| KaryoMAX Colcemid | Gibco | 15212-012 | |
| HBSS Buffer | Gibco | 24020-117 | |
| 0.5% Trypsin EDTA 10x | Gibco | 15400-054 | |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| Buffer Tablets "GURR" | Gibco | 10580-013 | |
| Geimsa Stain | Ricca Chemical Company | 3250-16 | |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | ||
| Methanol | Caledon Laboratory Chemicals | 6700130 | |
| Glacial Acetic Acid | Krackeler Scientific Inc. | 11-9508-05 |
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