Chromosomenpräparation aus kultivierten Zellen
Summary
Chromosomen von lebenden Zellen, wie Lymphozyten oder Fibroblasten der Haut isoliert werden und aus Organismen, einschließlich Menschen oder Mäusen. Diese Chromosomen-Präparate können weitere für die Routine G-Banding und molekulare zytogenetischen Verfahren wie Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), komparative genomische Hybridisierung (CGH), und spektrale Karyotypisierung (SKY) genutzt werden.
Abstract
Chromosom (zytogenetische Analyse) wird weithin für den Nachweis von Chromosomen-Instabilität verwendet. Wenn durch G-Banding und molekularen Techniken wie Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH), gefolgt, hat dieser Test die leistungsfähige Möglichkeit, einzelne Zellen zu Aberrationen, die Gewinne oder Verluste von Abschnitten des Genoms und Umlagerungen, die ein oder mehrere Chromosomen betreffen analysieren. Bei Menschen, in etwa 1 pro 160 Lebendgeburten 1,2, 60-80% aller Fehlgeburten treten Chromosomenanomalien 3,4, 10% der Totgeburten 2,5, 13% der Personen mit angeborenen Herzfehlern 6, 3-6% der Unfruchtbarkeit Fällen 2 und bei vielen Patienten mit Entwicklungsverzögerung und der Geburtsdefekte 7. Zytogenetische Analyse der Bösartigkeit wird routinemäßig von Forschern und Klinikern verwendet, wie Beobachtungen von klonalen Chromosomenanomalien haben gezeigt, dass sowohl diagnostische als auch prognostische Bedeutung haben 8,9.60; Chromosomentrennung ist von unschätzbarem Wert für die Gentherapie und Stammzellforschung von Organismen einschließlich nicht-menschlichen Primaten und Nagetiere 10-13.
Chromosomen von Zellen von lebenden Geweben, einschließlich Blut-Lymphozyten, Haut-Fibroblasten, Amniozyten, Plazenta, Knochenmark und Tumorproben isoliert werden. Chromosomen werden in der Metaphase-Stadiums der Zellteilung analysiert, wenn sie am meisten verdichtet werden und damit deutlich sichtbar. Der erste Schritt des Chromosoms Isolationstechnik beinhaltet die Unterbrechung der Spindelfasern durch Inkubation mit Colcemid, um die Zellen ausgehend von der nachfolgenden Stufe Anaphase verhindern. Anschließend werden die Zellen mit einer hypotonischen Lösung behandelt und in ihrem gequollenen Zustand mit Carnoy-Fixiermittel erhalten. Die Zellen werden dann auf Objektträger fallengelassen, und können dann für eine Vielzahl von Verfahren verwendet werden. G-Banding beinhaltet Trypsin-Behandlung gefolgt von einer Färbung mit Giemsa zu charakteristischen hellen und dunklen Streifen zu schaffen. Das gleiche procedure Chromosomen isolieren können zur Herstellung von Zellen für die Verfahren, wie Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH), vergleichende genomische Hybridisierung (CGH), und die spektrale Karyotypisierung (SKY) 14,15 verwendet werden.
Introduction
Chromosomenanalyse ist eine herkömmliche Technik genutzt, um den Chromosom Instabilität und Umlagerungen, die zu genetischen Störungen und Bösartigkeit 1,2,8,9 diagnostizieren. Darüber hinaus kann eine höhere Auflösung für die Diagnose und Erforschung von Krebs-und Verfassungs erworbene genetische Anomalien mit der Kombination der klassischen zytogenetischen Verfahren und molekulare zytogenetischen Methoden wie Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), komparative genomische Hybridisierung (CGH) erreicht werden und spektrale Karyotypisierung (SKY) 14,15. In jüngerer Zeit haben diese Techniken für die Beurteilung von Chromosom Instabilität mit Stammzellen assoziiert genutzt. Karyotypischen Anomalien wie Aneuploidie von Langzeit kultivierten embryonalen Stammzellen (ES) und adulten Stammzellen aus verschiedenen Organismen wurden von mehreren Laboratorien gemeldet. Neuere Erkenntnisse unterstützt, dass einige Zelllinien sind von Natur aus eher auf Chromosom instabiNG unabhängig von den Kulturbedingungen. Aus diesem Grund wird bei der Festlegung und / oder Aufrechterhaltung von Mensch, Maus oder Rhesus Stammzelllinien, die Chromosomenanalyse wird als Teil der Qualitätskontrolle empfohlen. Viele Berichte beschreiben die zunehmendes Interesse an der Verwendung von Routine-und molekularen Zytogenetik, um die chromosomale Stabilität von Stammzellen und malignen Zellen oder verschiedenen Organismen in der Kultur 10-13 überwachen. Diese Protokolle werden zunehmend von nicht-genetischen Labors für die schnelle Chromosomen Bewertung ihrer kultivierten Zellen 13 verwendet. Wir stellen unsere grundlegende Verfahren zur Herstellung von Chromosom verschiedenen Zelltypen, die sowohl für klinische und Forschungszwecke und Zellen von verschiedenen Organismen stammen angewendet werden können.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir haben die vorliegenden Verfahren für Chromosom Isolierung aus Zellen von verschiedenen Organismen, einschließlich von verschiedenen humanen Zelltypen zu erhalten, Rhesus-Makaken, Ratten und Mäuse verwendet 11,20-22. Das Standardprotokoll vorgesehen ist, aber bestimmte Schlüsselschritte und Variablen benötigen, um für diese verschiedenen Arten von Zellen eingestellt werden. Mehrere spezifische Schritte in dem sowohl die chromosomale Herstellung und G-banding, um die bestmögliche Qualität der Ergebn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
In dieser Handschrift beschriebenen Arbeiten wurden mit Mitteln des Patrick F. Taylor Stiftung ermöglicht.
Materials
| KaryoMAX Colcemid | Gibco | 15212-012 | |
| HBSS Buffer | Gibco | 24020-117 | |
| 0.5% Trypsin EDTA 10x | Gibco | 15400-054 | |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| Buffer Tablets "GURR" | Gibco | 10580-013 | |
| Geimsa Stain | Ricca Chemical Company | 3250-16 | |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | ||
| Methanol | Caledon Laboratory Chemicals | 6700130 | |
| Glacial Acetic Acid | Krackeler Scientific Inc. | 11-9508-05 |
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