Summary
О восстановлении функциональных белков мембраны в гигантские липосомы определенного состава является мощным подходом в сочетании с патч-зажим электрофизиологии. Однако обычные производственные липосома гигантский могут быть несовместимы с стабильности белка. Мы описываем протоколы для производства гигантских липосом из чистого липидов или небольших липосом, содержащих ионные каналы.
Abstract
Восстановления ионных каналов в химически определенных липидов мембран для электрофизиологические записи был мощный метод для выявления и изучения функции этих важных белков. Тем не менее, классические препараты, такие как плоские бислоев, ограничивают манипуляций и эксперименты, которые могут быть выполнены на восстановленный канал и его мембрана среды. Чем больше клеточной структуры гигантских липосом позволяет традиционных патч-зажим эксперименты не жертвуя контролем липидного среды.
Electroformation является эффективным средством для получения гигантских липосом> 10 мкм в диаметре, который основан на применении переменного напряжения в тонкой липидной пленки упорядоченной осажденных на поверхности электрода. Однако, так как классический протокол предусматривает липидов на хранение из органических растворителей, не совместимы с менее надежными мембранных белков, как ионные каналы и должна быть изменена. В последнее время PRotocols были разработаны для Electroform гигантские липосомы из частично обезвоженной небольшой липосомы, которые мы адаптировали к белку содержащих липосомы в нашей лаборатории.
Мы приведем здесь фоне, оборудования, техники и ловушки electroformation гигантских липосом от небольших липосомы дисперсий. Начнем с классического протокола, которая должна быть освоена, прежде чем пытаться более сложные протоколы, которые следуют. Мы продемонстрировать процесс контролируемого частичному обезвоживанию малых липосом использованием паров равновесии с насыщенными растворами солей. Наконец, мы демонстрируем процесс electroformation себя. Мы опишем простым, недорогим оборудованием, которое может быть сделано в лабораторных условиях для производства высококачественного липосомы и описать визуальный осмотр подготовки на каждом этапе, чтобы обеспечить наилучшие результаты.
Introduction
Гигантские липосомы (часто называемые гигантские однослойные везикулы, или GUVs) имеют в основном были использованы для изучения физики и физической химии липидного бислоя, в том числе исследования двухслойных деформации, боковой фазе сосуществования («плоты»), слияние мембран и т.д. 1-4. Они имеют чрезвычайно клеточной структуры: сферической оболочки мембраны, окружающей водной внутренний которые могут быть легко сделаны различные чем окружающие водном буфере. Они, по определению, ≈ 1-100 мкм в диаметре, так что они могут быть отображены с использованием различных подходов свет микроскопии. Они могут быть сделаны тугими использованием осмотических градиентов или механически применяться напряжение, так что в то время как обычно мягкие, их свойства можно манипулировать для легкой обработки. В частности, управление «жесткость» в липосомы делает его простым, чтобы сформировать "липосомы прилагается» или вырезают патчи для электрофизиологии. В прошлом, ионный канал восстановления в значительной степени выполнена в плоской б липидовilayers. Теперь, способность образовывать пятна от гигантских липосом и использовать значительную дрожь средства, разработанные для обычных электрофизиологии (флуоресцентной микроскопии, микропипетки аспирации, быстрой перфузии и контроля температуры, и т.д.) делает гигантские липосомы более привлекательной для приготовления исследования 5,6.
Гигантские липосомы были сделаны многие стратегии. В самом деле, гигантские липосомы образуют спонтанно процесс набухания Когда сухой липидной пленки регидратируют 4,7,8. Желание быстрее подготовить большее, более равномерное липосом привело исследователей к другим подходам, главным из которых electroformation 1,9. Electroformation также зависит от гидратации высушенного липидную пленку, но ускоряет процесс путем применения переменного электрического поля через липидную пленку. Поле прикладывается через два электрода, либо проводов платины или индия-олова (ITO) покрытием предметные стекла, разделенных водой илибуфер и на которую липиды откладываются. За счет ускорения набухания липосомы, он достигает более высокий выход больше липосомы. Таким образом, electroformation стал метод по умолчанию для производства гигантских липосом 4.
Механизм electroformation полностью не изучен, и большинство из протоколов разработаны эмпирически (например, 10,11). Тем не менее, мы можем узнать немного о том, что ожидать с учетом теории и некоторые эмпирические результаты. Широко распространено мнение, что electroformation происходит при движении электро-осмотического потока буфера между отдельными бислоя липидов укладываются в осажденной липидная пленка 10,11. Электростатический связь с тепловыми флуктуациями липидного бислоя, вероятно, также участвуют 12. Эти гипотезы качественно предсказать верхний предел частоты электрического поля и силы, которые могут быть использованы 10,12. В частности, он предсказал, что решения высокой проводимостью (
Тем не менее, мембранные белки могут быть несовместимы с обычным методом осаждения липидов на электроды для electroswelling процедура, а именно в органических растворителях, которые затем выпаривают, чтобы оставить тонкой липидной пленки. Существуют два основных пути обойти эту трудность: включение белков после гигантских липосом, или адаптироваться, как липиды откладываются. Наш подход основан на других 5,11 внести липидов и восстановления имtuted мембранного белка вместе с суспензией малые или большие "протеолипосом". Мы описываем длительный и более сложный процесс производства протеолипосомами из очищенных белков и липидов в другом месте (Коллинз и Гордон, в обзоре). Здесь мы описываем протокола в отсутствие какого-либо белка, но это то же самое, когда белок включена; мы включаем результаты, показывающие, что протеолипосом содержащий ионный канал TRPV1 может быть преобразована в GUVs и используется для патч-зажим электрофизиологии. В любом electroformation подход, визуальный осмотр липидного образца во время процесса осаждения липид имеет решающее значение для успеха.
Наш подход может иметь отношение пределы специальной приложение восстановления ионного канала. За время как мы впервые разработана этот протокол и сейчас было также показано, каким образом способ, в котором липиды откладываются на электродах для electroformation влияет на композиционной гетерогенности результате GUVs. Baykаль-Caglar соавт. 14 показано, что GUVs сформированный из тщательно обезвоженный липосом была в 2,5 раза меньше изменение температуры растворимость переход GUVs сформированы из смеси различных фосфолипидов и холестерина. Их работа показывает, что липиды и особенно холестерина, может выпадать в осадок из липидной смеси при осаждении из органических растворителей, в результате чего большое пространственное изменение в составе осажденного липидной пленки. Это особенно важно для изучения фазового поведения липидов мембран, но также может иметь решающее значение для количественных экспериментов по функции ионного канала. Байкал-Caglar соавт. С протоколом похожа, но не идентична нашей, Читателям предлагается изучить его, а также.
Этот протокол (см. обзор, рис. 1) является одним из многих, которые могут быть использованы. В принципе успех electroformation зависит от смеси липидов, гидратации, температура, другие растворенные вещества (в частности, ионов), а такжеКонечно, напряжения и частоты, используемые в формировании. Как electroformation становится более понятным, мы рассчитываем усовершенствовать наш протокол больше.
Наконец, часто крутой кривой обучения в гальванопластики гигантские липосомы. Мы предлагаем освоение обычного протокола (разделы 1 и 4, и, при необходимости, раздел 5) перед обучением внести липидов из липосомальной суспензии (разделы 2-5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Осаждение липидов из органических растворителях: классического протокола
- Удалить липидов из хранения при -20 ° С или -80 ° С; нагреться до комнатной температуры. Внимание: липиды чрезвычайно гигроскопичным и многих чувствительных к кислороду. Крышка липидов в сухой газ аргон или азот, и на всех этапах минимуму воздействия воздуха.
- При необходимости приостановить липидов в хлороформе или циклогексана при 1-10 мг / мл; обратите внимание, что заявил концентрации производителей, как правило, только номинальным ВНИМАНИЕ: Носить соответствующие перчатки и другие средства индивидуальной защиты при использовании органических растворителей.. Снимите СИЗ быстро, если растворитель пролил на них, так как большинство материалов по-прежнему проницаемой для этих растворителей и они только обеспечивают временную защиту.
- Очистите обе стороны два 25 х 37,5 мм ITO покрытием слайды стекло с этанолом
- Смешать липиды, чтобы достичь желаемого молярных соотношениях. Для каждого 1 см 2 площади ITO скользит должна быть покрыта губаID, смешать ~ 15-20 мкг липидов. Например, если оба 25 х 37,5 мм слайды были быть полностью покрытый, мы обычно используют 30 мкл 10 мг / мл смеси липидов. Примечание: добавление 0,1% мол Texas Red-DPPE для флуоресцентных изображений, и см. ниже предупреждает о флуоресцентных красителей.
- Убедитесь, что ITO покрытой стороне стекла слайдов вверх путем измерения поверхностного сопротивления омметром или мультиметром.
- Аспирируйте липидов в устойчивые к растворителям шприца. Внимание: Нет клеев или полимерных материалов, кроме тефлона, следует обратиться в органическом растворителе.
- С помощью шприца игла не совсем касается поверхности ITO, медленно применить липидов перемещение иглы назад и вперед через слайда. Покройте поверхность, равномерно, ищет "радуги блеск" на поверхности стекла.
- Поместите препараты быстро под <1 Торр (1 мм рт.ст.) вакуума в течение 0,5-1 ч, чтобы удалить следы растворителя. Выпуск вакуум инертным газом.
- Нанесите силиконовую прокладку, стонким слоем силиконовой вакуумной смазки на обеих сторонах. Оставьте не менее 5 мм непокрытого слайд подвергается на одном конце слайда.
- Немедленно приступить к разделу 4.
2. Малый липосом для контролируемой Обезвоживание
- Подготовьте смесь липидов, как и в шаге от 1,1 до 1,4.
- Сушат липидов с помощью потока аргона или азота газа в 10-15 мм пробирку с культурой диаметра. Для небольших количеств липидов, ≤ 0,5 мг, в результате пленка может быть гидратированный непосредственно после размещения его в вакууме в течение 0,5-1 часов, чтобы удалить остаточный растворитель; перейти к этапу 2.5. Большие количества липидов как правило, ловушка органических растворителей в густой гель, даже под вакуумом и лучше подготовлены путем лиофилизации, см. шаги 2.3-4.
- Приостановить высушенной пленки липидов в циклогексана, крышка с аргоном и печать с пробкой, Поместите пробирку в холодный блок и заморозить при -80 ° С в течение 1 часа минимум.
- Поместите холодный блок и липидов образца в вакуумной системеспособных достигать 100 мтор. Применить вакуум, она будет "стойло" на расстоянии около 1 Торр в качестве растворителя сублимируется прочь. Как только растворитель полностью удаляют (~ 1 час) вакуумный упадет ниже этого уровня. Выпуск вакуум инертным газом и запечатать трубу или гидрат немедленно.
- В то время как липиды находятся под вакуумом, дегазации гидратации буфера с помощью вакуума и барботирования 15-17.
- Гидрат липиды использованием дегазированной буфере до конечной концентрации 1-10 мг / мл. Разрешить липидов для увлажнения медленно. Через 30 мин-1 ч, вихревые разбить оставшиеся сгустки. Ждать еще 0,5-1 часа для обеспечения полной гидратации. Используйте osmoticant, такие как сорбит или сахароза до 200 мм, чтобы в полной дегидратации в действия.
- Подготовка 100-200 нм, диаметр липосом экструзией. См. экструзии протоколом производителя за более подробной информацией. Следует отметить, что буфер должен иметь менее ~ 25 мМ ионной силы или специальные протоколы напряжение electroformation будут необходимы в разделе 4.
3.Осаждение липидов Контролируемые Обезвоживание малых липосомы
- Внимание: Наш протокол требует липидов быть помещены в равновесии с паром насыщенных солевых растворов в течение многих часов. Мы рекомендуем выполнения протокола в атмосфере инертного газа с использованием камеры с перчатками или аналогичных корпуса.
- Внимание: При подготовке образцов, содержащих белки, избежать полного обезвоживания. Гидрат атмосферы в любой корпус с стакан с теплой водой или на основе ультразвукового увлажнителя. Использование гигрометр для обеспечения есть по крайней мере 30% относительной влажности. Использование сорбитом или сахарозой в небольшом липосома буфер в качестве дополнительной меры предосторожности, чтобы избежать полного обезвоживания.
- Подготовка насыщенным раствором соли соответствующим относительной влажности. Цель влажность зависит от осмолярность препарата везикул. Для препаратов с физиологическим осмолярности, используйте 30-45% относительной влажности, в то время как низкий препараты везикул осмолярности может быть адекватно обезвоженной вравновесии с 75-90% относительной влажности (см. также таблицу 1).
- Положите насыщенный раствор соли и избыток соли в плотно закрывающуюся емкость с внутренняя полка. Коммерческая контейнеры для пищевых продуктов для работы йогурт и мюсли очень хорошо. Замените полку после заполнения, и убедитесь, что жидкость составляет 5-10 мм ниже полки.
- Чистый ITO покрытием слайды, как в разделе 1. Использовать мультиметр, чтобы определить, какая сторона является проводящей, и маркировать непроводящих бок с названия образца.
- Слегка смазать с обеих сторон силикон (USP класса VI), прокладку (ы) с одним или несколькими отверстиями.
- Поместите препараты проводящей стороной вверх на скамейке, и применить силиконовые прокладки (ей) каждый слайд, на который липидов будет применяться, убедившись, что есть по крайней мере 5 мм оголенного слайдов на одном конце для подключения к electroformation аппарата. Гладкая прокладка для обеспечения хорошего уплотнения.
- Развести препарат в пузырьке с низким содержанием соли isosmotic буфера до ~ 1-2 мг / мл. Мы считаем, что более высокие концобъема производят плохие результаты.
- Применить липидов к слайду в 1-10 мкл капли. Меньшие капель обычно производят лучшие результаты.
- Поместите слайд на внутренней полке над насыщенным раствором соли и запечатать контейнер плотно. Оставить при комнатной температуре в течение 3 часов, чтобы O / N. Контейнер может быть помещен при 4 ° С, но обратите внимание, что для некоторых солей RH сильно зависит от температуры, и холодный увеличит время установления равновесия.
- Полученная пленка может иметь легким блеском радуги к нему, но в любом случае должно появиться почти высушенной. Высоко осмотического исходных растворов может быть невозможно полностью высохнуть к липидной пленки, это не повлияет негативно на результаты.
4. Electroformation гигантских липосом
- Липид фильмов, особенно те, которые образованы из обезвоженных липосомы, которые легко удалить. Тщательно гидрат каждую лунку, помещая 27 G иглу шприца на краю прокладки и медленно применением буфера. Буферы могутвключают воду, ≤ 200 мМ сахарозы, 1 ≤ M ≤ сорбит и 5 мМ HEPES. Более 10 мм раствор соли может потребовать альтернативных протоколов electroformation напряжения. Переполнения каждой прокладки также на ~ 10%.
- Обратите внимание: как липиды увлажненной, проведен в кратчайшие сроки выполнить остальные действия, так как липидных пленок начинают расслаиваться немедленно. Доходность и размер увеличить, если бы electroformation начинается быстро.
- Одним плавным движением, нанесите второй слайд ITO, проводящий в лице, в начало прокладку. Удостоверьтесь, чтобы иметь по крайней мере 5 мм свес за пределами области прокладки и напротив первого навеса. Нажимайте мягко, чтобы обеспечить хорошее уплотнение.
- Очистите два свесы с использованием этанола и убедиться, что стороны, обращенные к прокладке являются проводящими с мультиметра.
- Камера может быть обеспечено дальнейшее парафином или светло-клипы натяжение пружины при желании.
- Подключите камеру electroformation к источнику напряжения, обеспечивая алюминия или меди бары, "EMI ГАСКET пена », или проводящих клейкой ленты с проводящими поверхностями двух слайдов. Мы используем EMI прокладки пены. Планы на джиг и зажим показано на рисунке 5.
- Убедитесь, что нет короткого замыкания между контактами, и что контакты правильно встать на ITO поверхности, используя мультиметр.
- Нагреть камеры 10 ° C выше самой высокой температуры плавления любого из липидов, присутствующих, например, в DPPC, нагревают до 52 ° C минимум, 10 ° С выше температуры плавления цепь 42 ° C.
- Для низким содержанием соли буферы, применять 10 Гц синусоидальной волны, ~ 0,7 В RMS для каждого миллиметра разрыв между двумя ITO покрытием поверхностей, в течение 60-90 мин. За высокие буферы соль, другие протоколы напряжения должны использоваться (см. ссылки).
5. Работа с изображениями и устранение неисправностей
- Изображение липосомы с использованием инвертированного микроскопа, снабженного фильтром куба для Родамин или Texas Red красителей. Липосомы должна иметь сферическую форму,однослойные преимущественно на глаз, и без дефектов, таких как «струн» висит у липосомы.
- Если липосомы слишком малы, использовать меньше липидов.
- Если есть много дефектов или нескольких липосомы, это может быть связано с гель-фазу липидов. Рассмотреть вопрос о повышении electroformation температуры.
- Если мало или совсем нет гигантские липосомы, образованные на всех из обезвоженных небольшой липосомы, снижение осмотической силы липосом буфера или увеличение осмотического сила electroformation буфера. Пусковой буфера в концентрированный раствор внедрения буфер может вызвать отслоение хранение липидной пленки.
- Если пузырек выход, качество, или размер плохое, и вы в том числе соли или рН буферов в electroformation липосомы или буферы, рассмотреть альтернативные протоколы electroformation напряжения. Например, Потта и соавт. 11, рекомендуют три шага протокола с использованием 500 Гц синусоида, повышение напряжения от 50-1,300 Vpp / м в течение 30 мин, выдержка в течение 90 минн уменьшения частоты до 50 Гц в течение 30-60 мин. Платиновый или титановые электроды могут быть необходимы в данном случае, но это не существенно изменить протокола.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В нашем примере мы готовить липосом из смеси приблизительно 55% мол POPC (1-пальмитоил-2-олеоил-Sn-глицеро-фосфохолина), 15% мол POPS (1-пальмитоил-2-олеоил-Sn-глицеро-фосфосерин , 30 моль% холестерина и 0,1 моль% Texas Red меченых 1,2-дипальмитоил-Sn-фосфоэтаноламин (TxR-DPPE). Эта композиция была выбрана в качестве представителя примерно спинных ганглиев липидов 18. Отметим, что 15% мол взимается липида (здесь POPS) находится вблизи предела того, что может быть использовано в electroformation (например Walde соавт. 4).
Липидов пробоя путем гидролиза и перекисного окисления является особенно важным вопросом для многих смесей липидов и многие чувствительные эксперименты (см. обсуждение). Для ясности в одиночку, мы не используем инертные атмосферы газа в видео-презентации. Как видно из приведенных ниже, это не заметно повлиять на качество липосомы, но для чувствительных исследований илиПри использовании высоко ненасыщенных липидов важно, чтобы предотвратить липидов пробой.
Так как главное препятствие в electroformation является формирование хорошей липидную пленку на оксида индия-олова (ITO) подложки, зная, что липидная пленка должна выглядеть после высыхания имеет решающее значение. Однако, когда electroformation не удается, он часто делает это полностью, что приводит к отсутствию заметных гигантских липосом. Часто, существенные детрита будет наблюдаться, это обычно означает, что слишком много липидов была использована. Наши данные показывают, что каждый ожидает увидеть на успех.
2 показаны два различных участков липосомы гальванопластики из липидов хранение из хлороформа. На левой панели, внимательно изучить пятна показано стрелками 2 и 3. В то время как указывает стрелка 2 патч с плохо различимыми липосомы, липосомы не может быть доставлен в центр внимания в области показано стрелкой 3. В совокупности эти данные свидетельствуют в целом плохоподготовка, вероятно, из-за наличия слишком много липидов откладывается в этой области. На правой панели, такие «нечеткие» регионах являются менее распространенными, что указывает на лучшую подготовку в целом. Мы считаем, что это редкий, чтобы полностью устранить такие недостатки.
На рисунке 3 показан липосомы успешно гальванопластики из липидов, сданный на хранение обезвоживания малых липосом, на двух увеличениях, отображаемого использованием Texas Red эпифлуоресцентной. Липосомы представляют собой редкие, но есть несколько хороших образцов. Поскольку размер варьируется, некоторые из них не в фокусе. Стрелки указывают три хороших липосомы качества размером от ~ 5-20 мкм, два из которых появляются в 40-кратном увеличении изображения. Обратите внимание на понятные "кольцо" на краю: это указывает на однослойные или почти однослойные липосомы. Хотя некоторые пятна липидов, похоже, рухнули или никогда не сформирован липидов, это хороший результат качества.
Наконец, наша цель в разработке и публикации этого протоколазаключается в подготовке GUVs с неповрежденными, функциональные млекопитающих ионных каналов, которые подходят для обычного патч-зажим электрофизиологии. На рисунке 4 мы демонстрируем капсаицин-активированной TRPV1 ионных токов записан в липидную мембрану патчи вырезали из GUVs формируются с использованием этого протокола. Ток может быть заблокирован рутений красный, и не активирован транспортного средства капсаицина (0,1%-ного этанола, 138 мМ NaCl, 3 мМ HEPES, рН 7,4) в покое. Подготовка протеолипосом для экспериментов электрофизиологии выходит далеко за рамки настоящего протокола, но является предметом представлены статьи.
| Соль | Моляльность при 20 ° C и насыщенность | % Относительной влажности при 10 ° C | % Относительной влажности при 20 ° C | % Относительной влажности при 30 ° C |
| Хлорид магния гексагидрат | 5,8 | 33 | 33 32 | |
| Калия карбонат Дигидрата | 8,0 | 47 | 44 | 42 |
| Натрия бромид | 4,6 | 58 | 57 | 57 |
| Хлорид меди | 5,6 | 68 | 68 | 67 |
| Хлористый натрий | 6,13 | 75 | 75 | 75 |
| Хлористый калий | 4,61 | 87 | 86 | 84 |
Таблице 1. Относительная влажность (% RH) из нескольких общих данных солей Относительная влажность от 19 Гринспена и Rockland 20;. Насыщения данным Международного важных таблиц 21.
Рисунок 1. Схема гигантские липосомы electroformation от малых липосом. (Вверху слева) Малый липосомы откладываются в массив мелких капель, <5 мкл. (Top центре) липосомы обезвожены при контролируемых относительной влажности, помещая их в герметичный контейнер над насыщенным раствором соли. Гигрометр является обязательным. (Вверху справа) После дегидратации с липкая пленка липидов и (возможно) osmoticant такие как сорбит, липиды регидратировали в гиперосмотические буфера (см. протокол раздел 5). (Внизу слева) electroformation герметизации камеры со второй слайд ITO на вершине. (Нижний правый) Наконец, в камере нагревается выше температуры плавления цепи липидов, и подключенный к источнику сигнала, обеспечивая осциллирующее электрическое поле между двумя слайдами ITO.
Рисунок 3. Гальванопластики гигантские липосомы, образованные от обезвоживания-хранение липидов. (Слева) на 10-кратным увеличением, несколько липосомы видны. Три липосомы помечены. (Справа) же вид, как на левом, при 40-кратном увеличении, с тем желипосомы (2 и 3), меченого. Число этих липосом, как правило, значительно меньше, чем при гальванопластики с растворителем хранение липидов, но вполне достаточно для многих целей. Отображаемого использованием перевернутой эпифлуоресцентной микроскоп с Chroma 41004 Texas Red фильтром куба и Стэнфордского Photonics XR/MEGA-10 S30 усилились CCD камеры. 
Рисунок 4. Капсаицин активированный TRPV1 текущего записаны в мембране патч вырезали из GUV формируются с использованием этого протокола. А. Ток утечки указано 500 МОм сопротивление уплотнения до капсаицина было добавлено. В. Насыщение капсаицин (> 20 мкм, 0,1% этанола) активирует большой TRPV1 тока;. текущем блокируется рутений красный, и не активирован транспортное средство (0,1%-ный этанол в буфере) один (данные не показаны) C. текущий возвращаетсядо ближней базовой как капсаицин вымывается из патча. 
Рисунок 5. Планы electroformation камеры. Включен обзор, показывающий полную сборку и размеры схемы для верхней и нижней пластмассовых деталей. Использование акриловой или другой легко обработанной прозрачного пластика. Тонкая пленка Kapton нагреватель должен быть соединен с контроллером температуры (см. таблицу конкретных реагентов и оборудования) и пена EMI прокладки должна быть подключена к функциональным генератором, так что синусоидальный сигнал подается через два ITO покрытием слайды. Отверстие предусмотрено для датчика температуры. Плоская 10-32 винтов помещаются в потайной отверстия в нижней части, и проходят через верхнюю часть. 10-32 орехи используются для крепления сборки. При полном качествесобранном, верхней и нижней части пластиковой должна быть заподлицо друг к другу с двух сторон (стороны, параллельные EMI прокладки.) Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Electroformation гигантских липосом превратился в гибкую технику совместимы с различным липиды, препараты, и буферы. Тщательный контроль процесса осаждения липидов наиболее важными для успеха. Мы представили простые инструменты, чтобы сделать контролируемое осаждение липидов из небольших липосомы препаратов простой процесс. Относительная влажность имеет решающее значение для надлежащего обезвоживание начального липосомы, и оптимальное значение будет меняться в зависимости от начальной концентрации растворенных веществ в суспензии липосом. Нижняя относительная влажность требуется для обезвоживания более концентрированные образцы к адекватному уровню.
Точный протокол гидратации и электрического поля используется для electroformation остается предметом обсуждения 1,4,7,10,11,22. Простых протоколов должны быть освоены, прежде чем пытаться липосомы electroformation в присутствии высоких концентраций солей, заряженные липиды, или очень высокие концентрации высоких расплаваING температуры липиды. После того как эти навыки освоены, более продвинутые протоколы обычно делят electroformation процесса на три части: начальный отек, роста и отряда. Начальная отеки, кажется, благоприятствует медленно увеличивая приложенное электрическое поле 11. Второй, дополнительный этап при фиксированной напряженности поля может помочь контролировать конечный размер липосом. Наконец, снизить частоту переменного поля может помочь отделить липосомы с поверхности ITO. Более высокие частоты, необходимые для Electroform липосом в физиологических условиях соль 11, но липосомы могут быть сформированы в чрезвычайно широком диапазоне поле частоты и амплитуды 10.
Тот факт, что гигантские липосомы сформирует спонтанно после регидратации обезвоженного липосомы с гипоосмотических буфера 7 указывает несколько ключей к успеху. Во-первых, липосомы, отек процесс начинается немедленно, так что для electroformation, некоторыегрупп даже сочли целесообразным применить переменного электрического поля до станавливающим липидную пленку 10. Во-вторых, вполне вероятно, что поток жидкости приводит липосомальными процесс набухания, и что electroformation происходит по крайней мере, отчасти потому, что электро-приводом осмотического потока. Это накладывает ограничения на полезную частоты и амплитуды диапазон, который может быть использован в electroformation 10.
Главный предмет обсуждения в последние несколько лет был потенциал для гидролиза липидов и перекисное 23,24. Первую защиту против деградации липидов любого вида для удаления кислорода из всех материалов, используемых при подготовке GUV: так как перекисное зависит от молекулярного кислорода 23, это должно замедлить процесс. Сочетание вакуума и барботирование инертного газа должна быть использована для удаления больше кислорода, чем возможный 15-17. Ультразвуковая обработка и легкого вакуумного неэффективны. Мы используем комплект кислорода теста (Chemetrics K7501) до Verify, что мы удалили кислород как можно тщательнее. Гидролиз более пагубного, но снижается, если поддерживать нейтральную рН 25, а за счет снижения напряжения используется в electroformation 24. Некоторые авторы выступают за использование титановыми электродами вместо ITO скользит 23,24,26,27. Мы предпочитаем, чтобы избежать возможности загрязнения наших образцах с титаном (или любой металл), так как это было в прошлом, как известно, мешают липосомы экспериментов 28,29, но это может помочь предотвратить некоторые перекисное окисление или гидролиз эффектов. Само собой разумеется, что длительное воздействие высокой температуры ускоряет липидный пробоя 30. Наконец, тонкослойной хроматографии 24,31, колориметрических анализов 23 и другие методы 31 существовать количественно липидов деградации.
Аналогичная проблема связана с флуоресцентными красителями липидов использовали изображения GUVs, особенно для исследования бокового разделения фаз 30,32 30,33, и использоваться при минимальной концентрации.
Мы не известно о каких-либо консенсуса по вопросу слайды ITO электродов можно использовать повторно. Многие группы делают повторно использовать свои ITO слайды, а некоторые нет. Недавнее исследование показывает, что слайды сделать ухудшить течение долгого времени, но можно отжигать, чтобы восстановить высокую производительность 34; это ухудшение было лишь небольшое влияние на липидные смеси, включая цвиттерионные или анионные липиды, но имеет решающее значение для смесей, содержащих катионные липиды. Мы повторно использовать слайды без отжига.
Несмотря на большую изменчивость в протоколы, используемые для Electroform гигантские липосомы, теоретическое понимание и практический опыт работы с техникой постоянно совершенствуется. Уже липосомы могут быть сформированы с большим количеством заряженные липиды, или в высоких буферов соли. Ключ остается эффективным отложение липидов на поверхности электрода, whicч является основой нашего протокола.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим Венема Брайан и Эрик Мартинсон построения electroformation аппарата. Эта работа финансировалась грантами от Национального института общих медицинских наук Национального института здоровья (R01GM100718 к SEG) и Национального Института глаза Национального института здоровья (R01EY017564 к SEG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digital Multimeter | Agilent Technologies, www.agilent.com | U1232A or similar | Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test. |
| Fluke | 117 or 177 | Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test. | |
| Function Generator | Agilent Technologies, www.agilent.com | 33210A or similar | Most function generators work for simple protocols. This programmable model is useful for advanced electroformation protocols. Make sure the generator can drive 10 V peak-to-peak into a 50 Ω load |
| ITO coated glass slides | Delta Technologies, Loveland, CO www.delta-technologies.com | CB-90IN-S107 or similar | Break these in half to make two slides, 25 mm x 37 mm |
| Temperature controller | Omega Engineering Stamford, CT www.omega.com | CNi3233 or similar | |
| Hygrometer | Extech, Nashua, NH, www.extech.com | 445815 | |
| Silicone rubber sheet | McMaster-Carr Elmhurst, IL www.mcmaster.com | 87315K64 | Use USP Grade VI silicone for its high purity |
| EMI gasket | Laird Technologies www.lairdtech.com | 4202-PA-51H-01800 or similar | Distributed by Mouser www.mouser.com |
| TxR-DHPE | Life Technologies, Carlsbad, CA www.lifetechnologies.com | T1395MP | Other fluorescently labeled lipids are available, but TxR-DHPE is one of the brightest and most photostable. |
| POPC | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL www.avantilipids.com | 850457P or 850457C | Lipids can be ordered as powders (P) or in chloroform (C) |
| POPS | Avanti Polar Lipids | 840034P/C | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 |
References
- Dimova, R., Aranda, S., Bezlyepkina, N., Nikolov, V., Riske, K. A., Lipowsky, R. A practical guide to giant vesicles. Probing the membrane nanoregime via optical microscopy. Journal of Physics-Condensed Matter. 18 (28), S1151-S1176 (2006).
- Giant Vesicles. Luisi, P. L., Walde, P. , John Wiley & Sons Ltd. (2000).
- Riquelme, G., Lopez, E., Garcia-Segura, L. M., Ferragut, J. A., Gonzalez-Ros, J. M. Giant liposomes: a model system in which to obtain patch-clamp recordings of ionic channels. Biochemistry. 29 (51), 11215-11222 (1990).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: preparations and applications. Chembiochem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Aimon, S., Manzi, J., Schmidt, D., Poveda Larrosa, J. A., Bassereau, P., Toombes, G. E. S. Functional reconstitution of a voltage-gated potassium channel in giant unilamellar vesicles. PLoS. One. 6 (10), e25529 (2011).
- Girard, P., Pecreaux, J., Lenoir, G., Falson, P., Rigaud, J. L., Bassereau, P. A new method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles. Biophys. J. 87 (1), 419-429 (2004).
- Manley, S., Gordon, V. D. Making giant unilamellar vesicles via hydration of a lipid film. Curr. Protoc. Cell. Biol. 24, 1-13 (2008).
- Rodriguez, N., Pincet, F., Cribier, S. Giant vesicles formed by gentle hydration and electroformation: a comparison by fluorescence microscopy. Colloids. Surf. B. Biointerfaces. 42 (2), 125-130 (2005).
- Angelova, M. I., Soleau, S., Meleard, P., Faucon, J. F., Bothorel, P. Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Kinetics and applications. Progressin Colloid & Polymer Science. 89, 127-131 (1992).
- Politano, T. J., Froude, V. E., Jing, B., Zhu, Y. AC-electric field dependent electroformation of giant lipid vesicles. Colloids. Surf. B. Biointerfaces. 79 (1), 75-82 (2010).
- Pott, T., Bouvrais, H., Méléard, P. Giant unilamellar vesicle formation under physiologically relevant conditions. Chem. Phys. Lip. 154 (2), 115-119 (2008).
- Sens, P., Isambert, H. Undulation Instability of Lipid Membranes under an Electric Field. Phys. Rev. Lett. 88 (12), (2002).
- Green, N. G., Ramos, A., González, A., Morgan, H., Castellanos, A. Fluid flow induced by nonuniform ac electric fields in electrolytes on microelectrodes. I. Experimental measurements. Phys. Rev. E. 61 (4), 4011-4018 (2000).
- Baykal-Caglar, E., Hassan-Zadeh, E., Saremi, B., Huang, J. Preparation of giant unilamellar vesicles from damp lipid film for better lipid compositional uniformity. Biochim. Biophys. Acta. 1818 (11), 2598-2604 (2012).
- Bakalyar, S. R., Bradley, M. P. T., Honganen, R. The role of dissolved gases in high -performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 158 (0), 277-293 (1978).
- Brown, J. N., Hewins, M., Van Der Linden, J. H. M., Lynch, R. J. Solvent degassing and other factors affecting liquid chromatographic detector stability. J. Chromatogr. A. 204, 115-122 (1981).
- Dolan, J. W. Mobile Phase Degassing-Why, When, and How. LC-GC. 17 (10), 909-912 (1999).
- Cheng, H., Jiang, X., Han, X. Alterations in lipid homeostasis of mouse dorsal root ganglia induced by apolipoprotein E deficiency: a shotgun lipidomics study. J. Neurochem. 101 (1), 57-76 (2007).
- Greenspan, L. Humidity fixed points of binary saturated aqueous solutions. J. Res. Natl. Bur. Stand. 81 (1), 89-96 (1977).
- Rockland, L. B. Saturated Salt Solutions for Static Control of Relative Humidity between 5 ° and 40 °C. Anal. Chem. 32 (10), 1375-1376 (1960).
- Washburn, E. W. International Critical Tables of Numerical Data, Physics, Chemistry and Technology (1st Electronic Edition). , 216-249 (2003).
- Estes, D. J., Mayer, M. Giant liposomes in physiological buffer using electroformation in a flow chamber. Biochim. Biophys. Acta. 1712 (2), 152-160 (2005).
- Ayuyan, A. G., Cohen, F. S. Lipid Peroxides Promote Large Rafts: Effects of Excitation of Probes in Fluorescence Microscopy and Electrochemical Reactions during Vesicle Formation. Biophys. J. 91 (6), 2172-2183 (2006).
- Morales-Penningston, N. F., Wu, J., et al. GUV preparation and imaging: minimizing artifacts. Biochim. Biophys. Acta. 1798 (7), 1324-1332 (2010).
- Grit, M., de Smidt, J. H., Struijke, A., Crommelin, D. J. Hydrolysis of phosphatidylcholine in aqueous liposome dispersions. Int. J. Pharm. 50 (1), 1-6 (1989).
- Zhou, Y., Berry, C. K., Storer, P. A., Raphael, R. M. Peroxidation of polyunsaturated phosphatidyl-choline lipids during electroformation. Biomaterials. 28 (6), 1298-1306 (2007).
- Farkas, E. R., Webb, W. W. Multiphoton polarization imaging of steady-state molecular order in ternary lipid vesicles for the purpose of lipid phase assignment. J. Phys. Chem. B. 114 (47), 15512-15522 (2010).
- Hauser, H. O. The effect of ultrasonic irradiation on the chemical structure of egg lecithin. Biochem. Biophys. Res. Commun. 45 (4), 1049-1055 (1971).
- Hauser, H. Phospholipid vesicles. Phospholipids Handbook. Cevc, G. , Marcel Dekker, Inc. New York, New York. (1993).
- Veatch, S. L. Electro-formation and fluorescence microscopy of giant vesicles with coexisting liquid phases. Meth. Mol. Biol. 398, 59-72 (2007).
- Kim, R. S., LaBella, F. S. Comparison of analytical methods for monitoring autoxidation profiles of authentic lipids. J. Lipid. Res. 28 (9), 1110-1117 (1987).
- Veatch, S. L., Leung, S. S. W., Hancock, R. E. W., Thewalt, J. L. Fluorescent probes alter miscibility phase boundaries in ternary vesicles. J. Phys. Chem. B. 111 (3), 502-504 (2007).
- Juhasz, J., Davis, J. H., Sharom, F. J. Fluorescent probe partitioning in GUVs of binary phospholipid mixtures: implications for interpreting phase behavior. Biochim. Biophys. Acta. 1818 (1), 19-26 (2012).
- Herold, C., Chwastek, G., Schwille, P., Petrov, E. P. Efficient electroformation of supergiant unilamellar vesicles containing cationic lipids on ITO-coated electrodes. Langmuir. 28 (13), 5518-5521 (2012).
