De zebravis als model bij diabetes mellitus en Metabole Geheugen

Summary

Metabole geheugen is het verschijnsel waarbij diabetische complicaties bestaan ​​en vooruitgang onbelemmerd zelfs na euglycemie farmaceutisch wordt bereikt. Hier beschrijven we een diabetes mellitus zebravismodel die uniek omdat het zorgt voor het onderzoek van de mitotische overdraagbare epigenetische componenten van het metabool geheugen<em> In vivo</em>.

Abstract

Diabetes mellitus treft momenteel 346 miljoen mensen en dit zal naar verwachting tot 400 miljoen in 2030. Bewijs uit zowel het laboratorium en grootschalige klinische studies is gebleken dat diabetische complicaties vooruitgang ongehinderd via het fenomeen van de metabole geheugen, zelfs als de glykemische controle farmaceutisch wordt bereikt. Genexpressie stabiel kan worden veranderd door epigenetische veranderingen die niet alleen in staat cellen en organismen om snel op veranderende milieu stimuli ook verlenen het vermogen van de cel om "onthouden" deze ontmoet wanneer de stimulus verwijderd wordt. Als zodanig zijn de rollen die deze mechanismen spelen in de metabole geheugen fenomeen momenteel onderzocht.

We hebben onlangs gemeld de ontwikkeling van een zebravis model van diabetes mellitus type I en kenmerk van dit model dat diabetische zebravis tonen niet alleen de bekende secundaire complicaties inclusief de bijbehorende veranderingenmet diabetische retinopathie, diabetische nefropathie en een verstoorde wondgenezing, maar ook vertonen verminderde staartvin regeneratie. Dit model is uniek omdat de zebravis staat zijn beschadigde pancreas regenereren en euglycemische toestand vergelijkbaar met wat zou worden verwacht na transplantatie menselijke patiënten herstellen. Bovendien meerdere ronden van staartvin amputatie kan een scheiding en studie van pure epigenetische effecten in een in vivo systeem zonder potentieel complicerende factoren van de vorige diabetische toestand. Hoewel euglycemie wordt bereikt na pancreas regeneratie, de diabetische secundaire complicatie van fin regeneratie en de huid wondgenezing blijft voor onbepaalde tijd. In het geval van verminderde fin regeneratie wordt deze pathologie blijft ook na meerdere rondes van fin regeneratie in de dochter fin weefsels. Deze waarnemingen wijzen op een onderliggende epigenetische proces bestaat in de metabole toestand van het geheugen. Hier presenteren we de methoden die nodig zijn om met succes generate de diabetische en metabole geheugen groepen vis en discussiëren over de voordelen van dit model.

Introduction

Diabetes mellitus (DM) is een ernstig en groeiend gezondheidsprobleem dat resulteert in een verminderde levensverwachting als gevolg van ziekte-specifieke microvasculaire (retinopathie, nefropathie, neuropathie, gestoorde wondgenezing) en macrovasculaire (hart-en vaatziekten en beroerte) complicaties ^1. Eenmaal opgestart diabetische complicaties blijven vooruitgaan zonder onderbreking, zelfs wanneer de glykemische controle wordt ^2,3 bereikt en dit fenomeen is genoemd metabole geheugen of de erfenis effect. De aanwezigheid van dit fenomeen werd klinisch erkend tijdens de vroege jaren 1990 als de "The Diabetes Control and complicaties Trial (DCCT)" vorderde en sindsdien ondersteund door meerdere bijkomende klinische studies ^{4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14.} Diermodellen van DM zijn van cruciaal belang voor ontdekkingen met betrekking tot de pathofysiologie van diabetische complicaties en metabole geheugen. In feite was de persistentie van diabetische complicaties eerst beschreven in een hond model van diabetischeretinopathie die inmiddels is ondersteund door verschillende lijnen van experimenteel bewijs behulp van verschillende in vitro kweeksystemen en diermodellen ^{15,16,17,18,19,20,21.} Deze studies tonen duidelijk aan dat een eerste hyperglycemische periode resulteert in blijvende afwijkingen (waaronder afwijkende genexpressie) van doelorganen / cellen en mechanistisch de betrokkenheid van de epigenoom suggereert.

Epigenomes omvat alle chromatine modificaties voor een bepaald celtype en zijn verantwoordelijk voor unieke een cel genexpressieprofiel. De dynamische chromosoom wijzigingen zijn tijdens de ontwikkeling, ondersteuning celdifferentiatie, reageren op externe stimuli worden mitotisch stabiel overgeërfd ^22,23 en kunnen worden aangepast ziekte ^24,25,26. Deze epigenetische mechanismen zijn onder andere: post-translationele histonmodificaties, niet-canonieke histon variant opname in octomers, chromatine toegang veranderingen door middel van DNA-methylatie, en genexpressie controle door middel van niet-coderende RNA's micro ^27,28,29,30. In totaal epigenetische processen kunnen cellen / organismen om snel te reageren op veranderende prikkels uit de omgeving ^31,32,33, maar ook verlenen de mogelijkheid voor de cel om "onthouden" deze ontmoetingen zodra de stimulus ^23,22 verwijderd. Daarom, zoals veranderde genexpressie profielen gevolg van epigenetische processen stabiel in afwezigheid van het signaal (s) die ze geïnitieerd en erfelijk door celdeling hebben kregen ze groot belang als onderliggende moleculaire mechanismen van menselijke ziekten waaronder metabolische geheugen. De resultaten die zijn ontstaan ​​in het kader van DM en epigenetica parallel vooruitgang in andere ziekten die een overvloed van epigenetische veranderingen geïnduceerd door hyperglycemie veroorzaken opvallende blijvende veranderingen in transcriptienetwerken cellen (beoordeeld in ^{34,35,36,37,38).}

De zebravis is al lange tijd een van de beste modelorganisme om study de ontwikkeling van vertebraten echter de laatste 15 jaar heeft gezien een exponentiële groei in het gebruik van dit organisme voor de studie van de menselijke ziekte. ^39. Zebravis modellen van menselijke ziekten zijn vastgesteld die een breed scala van menselijke ziekten met inbegrip van genetische aandoeningen en verworven ziekte ^40,41,42. De vele voordelen van de zebravis ten opzichte van andere gewervelde modelorganismen zijn hoge vruchtbaarheid, korte generatietijd, transparantie door de vroege volwassenheid, verminderde woonlasten en een scala aan tools voor genetische manipulatie. Bovendien, dankzij de uitgebreide behoud van genetische routes en cellulaire fysiologie van de gewervelde en het vermogen om hoge throughput drug screenings uitgevoerd, is de zebravis succes gebruikt voor farmaceutische ontdekking.

We hebben een volwassen zebravis model van diabetes mellitus type I met de diabetogene drug, streptozocine. We hebben gekenmerkt dit model dat diabetische zebravis vertonen geent alleen de bekende humane secundaire complicaties maar daarnaast verminderde onderdeel regeneratie (staartvin regeneratie) vertonen als gevolg van de hyperglycemische milieu. Daarnaast hebben we gemeld dat hyperglycemische zebravis terugkeren naar normale glycemie binnen 2 weken verwijderen van het geneesmiddel door regeneratie van endogene pancreatische beta cellen resulterend in een fysiologisch normale glykemische toestand. In tegenstelling, onderdeel regeneratie in deze visresten verminderd in dezelfde mate als in de acute diabetische toestand waarin deze complicatie blijft en is gevoelig voor metabole geheugen. De belangrijkste impuls voor het genereren van dit model een systeem om de mitotisch stabiel epigenetische componenten die de metabole geheugen verschijnsel ondersteunen in de afwezigheid van de achtergrondruis van de vorige hyperglycemische milieu studie geven. Aan het einde van het protocol die hier de zebravis en of selectieve weefsels kunnen worden verwerkt door elke assay geschikt om de researchers nodig heeft. We hebben met succes gebruik gemaakt van deze procedure om het genoom-brede blijvende wijzigingen in DNA-methylering veroorzaakt door hyperglycemie die worden onderhouden in de metabole toestand van het geheugen ²¹ te identificeren.

Wij zijn van mening dat dit zebravis model van diabetes mellitus type I een aantal innovatieve voordelen ten opzichte van andere modelsystemen voor de behandeling van metabole geheugen heeft. 1) Al onze studies kunnen worden uitgevoerd in vivo en als de vorige hyperglycemische vis euglycemie terugkeren door regeneratie van endogene insulineproductie, ze vereisen exogene insuline. Daarom is dit voorkomt de complicerende spikes en dalen in de glycemische regulatie die zich kunnen voordoen bij dieren die exogene insuline. 2) Zoals hierboven beschreven, de achtergrond van de vorige stimulatie diabetische toestand (de voortdurende aanwezigheid van advanced glycation eindproducten en reactive oxygen species markers) worden geëlimineerd en daarom kan onderzoeken zuiver epigenetic factoren van metabole geheugen. 3) De experimenten snel worden uitgevoerd als het duurt ongeveer 80 dagen tot diabetes inductie metabole geheugen onderzoek. 4) staartvin regeneratie is experimenteel zeer toegankelijk en maakt een eenvoudige genetische en experimentele manipulatie waarvoor er een breed scala van instrumenten. 5) staartvin regeneratie geeft een zeer eenvoudige en meetbare wijze metabole geheugen beoordelen en bijgevolg zal de toekomst drug discovery.

Protocol

Alle procedures worden uitgevoerd volgens de richtlijnen beschreven in "Principles of Laboratory Animal Care" (National Institutes of Health publicatienr. 85 tot 23, herzien 1985) en de goedgekeurde Rosalind Franklin University Institutional Animal Care en gebruik Comite dier protocol 08 tot 19. Er zijn twee belangrijke gebruikte afkortingen in dit manuscript. 1) DM: verwijst naar vissen die in een acute (300 mg / dl) hyperglycemische toestand en zijn minstens 3 weken. 2) MM: verwi…

Representative Results

Type I diabetes zebravis niet alleen de bekende secundaire complicaties van retinopathie en nefropathie, maar ook, vertonen een extra complicatie: een gestoorde staartvin regeneratie. Deze latere complicatie blijft als gevolg van metabole geheugen in vis die normaal glucose controle hebben hersteld na een hyperglycemische periode. In figuur 2A (controle) en figuur 2B (metabolische geheugen) representatieve beelden regenereren vinnen die zijn gemaakt op 72 uur na amputatie gepresenteerd….

Discussion

Diabetes mellitus is een ziekte van metabole ontregeling, aanvankelijk gediagnosticeerd als hyperglycemie, die uiteindelijk resulteert in bloedvatbeschadiging leidt tot veel complicaties zelfs alle bestaan ​​na euglycemie wordt verwezenlijkt door farmaceutische interventie. Deze persistentie van complicaties wordt aangeduid als metabole geheugen en een aantal recente studies hebben de rol die epigenetische mechanismen spelen in dit fenomeen. Hier hebben gedetailleerd protocol dat zorgt voor het genereren van zowel a…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Streptozocin	Sigma Aldrich	S0130
2 phenoxyethanol	Sigma Aldrich	P1126
Scalpel (size 10)	Fisher Scientific	089275A
Petri Dishes	Fisher Scientific	08-757-13
½ cc syringe, with 27 1/2 gauge needle	Fisher Scientific	305620
QuantiChrome glucose assay kit.	Bioassay Systems	DIGL-100
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014
Dissecting Microscope	Nikon	TMZ-1500	Any dissecting microscope is fine.
Camera for Imaging	Nikon	Q imaging	Any camera is suitable.
Image J software	National Institutes of Health	NIH Image
NIS Elements	Nikon		Any imaging software is suitable.