דגם דג זברה של סוכרת וזכרון מטבולית

Summary

זכרון מטבולית הוא התופעה שמתרחשת סיבוכי סוכרת להתמיד ולהתקדם ללא הפרעה גם לאחר euglycemia מושגת pharmaceutically. כאן אנו מתארים מודל סוכרת דג זברה שהוא ייחודי בכך שהיא מאפשרת בדיקה של רכיבי epigenetic mitotically המסירים של זיכרון מטבולים<em> In vivo</em>.

Abstract

הסוכרת משפיעה כיום 346,000,000 אנשים וזה צפוי להגדיל עד 400 מ'עד 2030. ראיות מהמעבדה והן בניסויים קליניים בקנה מידה גדולים גילו כי התקדמות סיבוכי סוכרת ללא הפרעה דרך התופעה של זיכרון מהטבולים גם כאשר שליטה הגליקמית מושגת pharmaceutically. ביטוי גנים יכול להשתנות ביציבות באמצעות שינויי epigenetic שלא רק מאפשרים לתאים ואורגניזמים כדי להגיב במהירות לשינויים בגירויים סביבתיים, אלא גם העניק לו את היכולת של התא כדי "לזכור" מפגשים אלו פעם הגירוי מוסר. ככזה, את התפקידים שמנגנונים אלה לשחק בתופעת הזיכרון מהטבולים כעת, נבדקים.

יש לנו דיווח לאחרונה הפיתוח של מודל דג זברה מסוג אני סוכרת ומאופיינת במודל זה כדי להראות שדג זברה הסוכרתי להציג את הסיבוכים מהשניים הידועים, כולל שינויים הקשורים לא רקעם רטינופתיה סוכרתית, נפרופתיה סוכרתית וריפוי פצעים לקוי אלא גם תערוכת התחדשות סנפיר זנב נפגע. מודל זה הוא ייחודי בכך שדג הזברה הוא מסוגל להתחדש הלבלב הפגוע שלה ולשקם את מדינת euglycemic דומה למה שניתן היה לצפות בחולים אנושיים שלאחר ההשתלה. יתר על כן, סבבים רבים של קטיעת סנפיר זנב לאפשר הפרדה ומחקר על השפעות epigenetic טהורות במערכת vivo ללא גורמי סיבוך פוטנציאליים מהמצב הסוכרתי הקודם. למרות euglycemia מושגת בעקבות התחדשות לבלב, הסיבוך מהשני של התחדשות הסוכרתית סנפיר וריפוי פצעי עור נמשך ללא הגבלה זמן. במקרה של התחדשות סנפיר לקויה, פתולוגיה זו נשמרה גם לאחר סבבים רבים של התחדשות סנפיר ברקמות הסנפיר בת. תצפיות אלו מצביעות על תהליך epigenetic בסיסי הקיים במדינת הזיכרון מהטבולים. כאן אנו מציגים את השיטות הדרושות להצלחת genקרוא את קבוצות זכרון סוכרת וחילוף חומרים של דגים ולדון ביתרונות של מודל זה.

Introduction

סוכרת (DM) היא בעיה בריאותית רצינית, וצמיחתו, שגורם לקיצור תוחלת חיים בשל כלי דם מחלה ספציפיים (רטינופתיה, נפרופתיה, נוירופתיה ריפוי, ליקוי פצע) וmacrovascular (מחלות לב ושבץ) סיבוכים ^1. סיבוכי סוכרת, ברגע שיזמו ממשיכים להתקדם ללא הפרעה גם כאשר שליטה הגליקמית מושגת ^2,3 ותופעה זו זכתה לכינוי זיכרון מטבולים או השפעת המורשת. נוכחותה של תופעה זו הוכרה קלינית בתחילת 1990 כ" לשלוט בסוכרת וסיבוכי המשפט (DCCT) "התקדם ומאז כבר נתמך על ידי ניסויים קליניים נוספים מרובים ^{4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14.} מודלים של בעלי חיים של DM היו קריטיים לתגליות הקשורים לפיזיולוגית פתים-של סיבוכי סוכרת וזיכרון מטבולים. למעשה, ההתמדה של סיבוכי סוכרת תועדה לראשונה במודל של כלבים סוכרתייםרטינופתיה שמאז נתמכת על ידי מספר קווים של ראיות ניסיוניות תוך שימוש במגוון מערכות בתרבות מבחנה ומודלים של בעלי חי ^{15,16,17,18,19,20,21.} מחקרים אלו מראים בבירור כי תוצאות תקופת hyperglycemic ראשוניות בהפרעות קבע (כולל ביטוי גנים חריג) של איברי המטרה / תאים ומכאניים מרמזות על המעורבות של epigenome.

Epigenomes כולל את כל השינויים שהכרומטין לסוג תא נתון והם אחראים לפרופיל ביטוי הגנים הייחודיים של תא. שינויי כרומוזום הם דינמיים במהלך התפתחות, התמיינות תאי תמיכה, מגיבים לגירויים חיצוניים, mitotically עוברים בירושה ביציבות ^22,23 וניתן לשנות במחלה ^24,25,26. מנגנוני epigenetic אלה כוללים: לפרסם שינויי translational היסטון, הכללת גרסת היסטון הלא קנוניה בoctomers, שינויי גישת הכרומטין באמצעות מתילציה DNA, וגניםביטוי שליטה באמצעות קידוד הלא RNAs מייקר ^27,28,29,30. בסך הכל, תהליכי epigenetic לאפשר לתאים / אורגניזמים כדי להגיב במהירות לשינויים בגירויים סביבתיים ^31,32,33, הם גם העניקו לו את היכולת לתא כדי "לזכור" מפגשים אלו פעם הגירוי מוסר ^23,22. לכן, כמו פרופילי ביטוי גנים שעברו שינוי כתוצאה מתהליכי epigenetic הם יציבים בהיעדר האות (הים) שיזם אותם והם תורשתיים באמצעות חלוקת תא, שהם צברו עניין רב כבסיס מנגנונים מולקולריים של מחלות אנושיות, כולל זיכרון מטבולים. את התוצאות כי הם מתעוררים בהקשר של DM ואפיגנטיקה התקדמות מקבילה במחלות אחרות שבשפע של שינויים הנגרמים על ידי epigenetic היפרגליקמיה גורם לשינויים קבועים מדהימים ברשתות תעתיק של תאים (שנסקר ^{ב34,35,36,37,38).}

דג הזברה כבר זמן רב אורגניזם מודל מוביל לסטופיתוח חוליות dy זאת 15 השנים האחרונות ראה צמיחה המעריכית בניצול אורגניזם זה למחקר של מחלות אנושיות. ^39. מודלים של מחלות אנושיות דג זברה כבר הוקמו פורשים מגוון רחב של פתולוגיות אדם כולל הפרעות גנטיות ומחלות נרכשות ^40,41,42. את היתרונות הרבים של דג הזברה על אורגניזמים מודל חוליות אחרים כוללים פוריות גבוהה, זמן דור קצר, שקיפות דרך הבגרות מוקדמת, צומצמו הוצאות שכר דירה ומערך של כלים למניפולציה גנטית. יתר על כן, בשל השימור הנרחב של מסלולים גנטיים ופיזיולוגיה סלולרית בקרב בעלי החוליות והיכולת לבצע הקרנות סמי קצב העברת נתונים גבוהות, דג הזברה שמש בהצלחה לגילוי תרופות.

פתחנו מודל דג זברה בוגר בסוכרת מסוג I המשתמשת בסמי diabetogenic, streptozocin. יש לנו מאופיין במודל זה כדי להראות שדג זברה סוכרתי לאלא להציג רק את הסיבוכים משניים האדם הידועים, אך בנוסף, הם מציגים החייאת איברים לקויה (התחדשות סנפיר זנב) כתוצאה מסביבת hyperglycemic. בנוסף, יש לנו דיווח שדג זברת hyperglycemic לחזור glycemia הנורמלי בתוך 2 שבועות של הסרת תרופה בשל התחדשות של תאים בטאו בלבלב וכתוצאה מכך אנדוגניים מדינת גליקמי פיסיולוגי נורמלית. עם זאת, בניגוד לכך, החייאת איברים בדגים אלה נותרת לקויים באותה המידה כמו במצב הסוכרתי החריף המציין סיבוך זה נמשך והוא רגיש לזיכרון מטבולים. הדחיפה העיקרית ליצירת מודל זה הייתה לספק מערכת כדי ללמוד את מרכיבי mitotically היציבים epigenetic התומכים בתופעת הזיכרון מהטבולים בהעדר רעש רקע סביבת hyperglycemic הקודמת. בסיומו של הפרוטוקול המסופק כאן את רקמות דג הזברה וסלקטיבית או יכולות להיות מעובד על ידי כל בדיקה מתאימה לresearchers צריך. אנחנו השתמשנו בהצלחה בהליך זה כדי לזהות את שינויי הגנום המתמשכים במתילציה DNA הנגרמים על ידי היפרגליקמיה שנשמרים בזיכרון מטבולי המדינה ^21.

אנו חשים כי מודל דג זברה זה מסוג שהסוכרת יש מספר יתרונות על פני מערכות חדשניים מודל אחרות לבחינת זיכרון מטבולים. 1) כל המחקרים שלנו יכול להתנהל בvivo וכדגי hyperglycemic הקודמים לחזור לeuglycemia דרך התחדשות של ייצור האינסולין אנדוגני, הם אינם דורשים הזרקת אינסולין חיצונית. לכן, זה ימנע את הקוצים המסבכים ועמקים בשליטה הגליקמית שעלולות להתרחש בבעלי החיים הזקוקים לאינסולין אקסוגני. 2) כפי שתואר לעיל, גירוי הרקע מהמצב הסוכרתי הקודם (כלומר המשך נוכחותם של מוצרים סופיים glycation המתקדם וסמני מיני חמצן תגובתי) בוטל ולכן ניתן לבחון טהור epigגורמי enetic של זיכרון מטבולים. 3) הניסויים יכולים להתבצע במהירות כפי שהוא לוקח כ 80 ימים מאינדוקצית סוכרת עד בדיקת זיכרון מטבולים. 4) התחדשות סנפיר זנב היא ניסוי מאוד נגישה ומאפשרת מניפולציה גנטית וניסיונית קלה עבורה יש מגוון רחב של כלים. 5) התחדשות סנפיר זנב מספקת שיטה פשוטה מאוד וכמותיים להערכת זיכרון מטבולים, ולכן יאפשר לגילוי סמים בעתיד.

Protocol

כל ההליכים מתבצעים בעקבות ההנחיות המתוארות ב" עקרונות טיפול בבעלי חי מעבדה "(המכונים הלאומיים לבריאות אין פרסום. 85-23, מתוקן 1985) והטיפוח אושר רוזלינד פרנקלין האוניברסיטה המוסדי בעלי החיים והשתמשו ועדת חית פרוטוקול 08-19. יש 2 קי?…

Representative Results

הקלד דג זברה סוכרתי לא רק להציג את הסיבוכים משניים הידועים של רטינופתיה ונפרופתיה, אלא גם, מפגין סיבוך נוסף: התחדשות סנפיר זנב לקויה. סיבוך מאוחר יותר זה נמשך בשל זיכרון מטבולים בדגים ששוחזרו בקרת סוכר נורמלית לאחר תקופת hyperglycemic. באיור 2 א (שליטה) והתרשים 2…

Discussion

סוכרת היא מחלה של חוסר ויסות חילוף חומרים, אובחנה בתחילה כיפרגליקמיה, שסופו של דבר גורמת לניזק כלי דם שמוביל לסיבוכים רבים שנמשכים גם לאחר כל euglycemia המושגת למרות התערבות תרופות. התמדה זה של סיבוכים המכונית זיכרון מטבולים וכמה מחקרים שנערכו לאחרונה בחנו את התפקיד שמנג…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Streptozocin	Sigma Aldrich	S0130
2 phenoxyethanol	Sigma Aldrich	P1126
Scalpel (size 10)	Fisher Scientific	089275A
Petri Dishes	Fisher Scientific	08-757-13
½ cc syringe, with 27 1/2 gauge needle	Fisher Scientific	305620
QuantiChrome glucose assay kit.	Bioassay Systems	DIGL-100
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014
Dissecting Microscope	Nikon	TMZ-1500	Any dissecting microscope is fine.
Camera for Imaging	Nikon	Q imaging	Any camera is suitable.
Image J software	National Institutes of Health	NIH Image
NIS Elements	Nikon		Any imaging software is suitable.