糖尿病とメタボリックメモリーのゼブラフィッシュモデル

Summary

メタボリックメモリは、糖尿病合併症が持続し、正常血糖値は、薬学的に達成された後でも妨げられることなく進行する現象である。ここで我々はそれがメタボリックメモリの分裂伝染エピジェネティックな部品の検査を可能にするという点でユニークである糖尿病のゼブラフィッシュモデルを記述<em生体内で></em>。

Abstract

糖尿病は、現在3.46億個人に影響を与え、これは2030年を400万人に増加すると予測されています。実験室および大規模臨床試験の両方からの証拠は、糖尿病合併症の進行が血糖コントロールは、薬学的に達成されていても代謝のメモリ現象を介して、妨げられないことを明らかにした。遺伝子発現を安定細胞および生物が迅速に環境刺激の変化に対応できるようにするだけでなく、これらは刺激が除去され、一度遭遇 "記憶"する細胞の能力を付与するだけでなく、エピジェネティックな変化によって変更することができます。このように、これらのメカニズムはメタボリックメモリ現象で果たす役割は、現在検討されている。

我々は最近、I型糖尿病のゼブラフィッシュモデルの開発を報告し、関連する変更を含む既知の二次的合併症を表示するだけでなく、その糖尿病のゼブラフィッシュを表示するには、このモデルを特徴づけてきた糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症や障害創傷治癒を持つだけでなく、障害のある尾鰭の再生を示す。このモデルでは、ゼブラフィッシュは、その損傷した膵臓を再生し、移植後のヒト患者で予想されるものと同様の正常血糖の状態を復元することが可能であるという点でユニークです。また、尾鰭の切断の複数のラウンドは、前糖尿病状態からの潜在的な複雑な要因なしで分離し 、in vivo系で純粋なエピジェネティックな効果の研究を可能にします。正常血糖値は、膵臓の再生後に達成されるが、フィンの再生と皮膚創傷治癒の糖尿病二次性合併症は無期限に存続します。障害フィン再生の場合には、この病態であっても娘フィン組織におけるフィンの再生の複数のラウンド後も保持されます。これらの観​​察結果は、メタボリックメモリ状態に存在する基礎エピジェネティックなプロセスを指す。ここで我々は正常の世代に必要な手法を提示魚の糖尿病とメタボリックメモリーグループをerate、このモデルの利点について説明します。

Introduction

糖尿病（DM）は、深刻かつ成長健康問題であることを特定の微小血管疾患（網膜症、腎症、神経障害、障害、創傷治癒）および大血管（心臓病や脳卒中）合併症¹による平均寿命の低下をもたらす。一度開始されると、糖尿病の合併症は、血糖コントロールが^2,3を達成^した場合であっても中断せずに進行していき、この現象は、代謝メモリまたはレガシー効果と呼ばれています。この現象の存在は、 "糖尿病コントロールと合併症試験（DCCT）"として、1990年代初頭の間に臨床的に認識され^、進行し、複数の追加の臨床試験^{4,5,6,7,8,9,10}によってサポートされているので、 ^{11,12,13,14。} DMの動物モデルは、糖尿病の合併症とメタボリックメモリの病態生理学に関連する発見のために重要であった。実際には、糖尿病合併症の永続性は第一糖尿病のイヌのモデルで記述されていました以来、 体外培養系および動物モデル^{15,16,17,18,19,20,21} でのさまざまな方法を使って実験的ないくつかの証拠によって支えられてきた網膜症。これらの研究は、はっきり標的臓器/細胞の永久的な異常（異常な遺伝子発現を含む）の初期の高血糖期間の結果ことを示していると機構的エピゲノムの関与を示唆している。

Epigenomesは、指定されたセル·タイプのすべてのクロマチン修飾から構成され、細胞のユニークな遺伝子発現プロファイルを担当している。染色体の変更は、開発、サポート細胞分化の間に動的であり、外部刺激に応答する、有糸分裂的に安定して^22,23を継承され、病気^24,25,26に変更することができます。これらのエピジェネティックなメカニズムは次のとおり翻訳後ヒストン修飾、octomersにおける非正規ヒストンバリアントの取り込み、DNAメチル化を介してクロマチンアクセスの変更、および遺伝子をノンコーディングRNAはマイクロ^27,28,29,30を介して発現制御。要するに、エピジェネティックなプロセスは細胞/生物は速やかに環境刺激に^31,32,33の変化に対応できるように、彼らはまた、これらの刺激が^23,22を除去され、一度遭遇"暗記"する細胞の能力を付与する。エピジェネティックなプロセスから生じる変化した遺伝子発現プロファイルは、それらを開始し、細胞分裂を介して遺伝している信号（S）の非存在下で安定しているようなので、、彼らは、メタボリックメモリーを含む人間の病態の分子メカニズムの根底として大きな関心を集めている。高血糖によって誘発されるエピジェネティックな変化の茄多細胞^{（34,35,36,37,38}で検討）の転写ネットワークの著しい持続的な変化を引き起こすという点で、他の疾患のDMとエピジェネ平行進化の文脈で出現している結果。

ゼブラフィッシュは、長い学生に最初のモデル生物であったdyは、過去15年間しかし開発を脊椎動物、ヒトの疾患の研究のためにこの生物を利用した指数関数的に成長を遂げている^39。ヒト疾患のゼブラフィッシュモデルは遺伝性疾患や後天性疾患^40,41,42を含む人間の病理学の広い範囲にまたがる確立されている。他の脊椎動物のモデル生物上ゼブラフィッシュの多くの利点は、高い繁殖力、短い世代時間、早期成人期を通じて透明性、減少住宅費と遺伝子操作のためのツールの配列が含まれています。また、脊椎動物およびハイスループット薬物スクリーニングを実行するための能力の間の遺伝的な経路および細胞生理の広範な保全のため、ゼブラフィッシュが正常医薬品発見のために使用されてきました。

我々は、糖尿病薬、ストレプトゾシンを使用して、I型糖尿病の成人のゼブラフィッシュモデルを開発した。私たちにはその糖尿病ゼブラフィッシュを表示するには、このモデルを特徴付けなかったtは唯一の既知のヒト二次的合併症を表示するが、それに加えて、高血糖環境の結果として障害四肢再生（尾鰭再生）を示す。加えて、我々は高血糖ゼブラフィッシュは、生理学的に正常な血糖状態となる内因性膵β細胞の再生のために薬物除去から2週間以内に正常な血糖に戻すことを報告している。この合併症を示す急性糖尿病の状態が続くとメタボリックメモリに影響されやすいようにしかし、これとは対照的に、これらの魚類における四肢再生が同程度に損なわれたまま。このモデルを生成するための主な原動力は、以前の高血糖環境のバックグラウンドノイズのない状態で代謝メモリ現象をサポートする有糸分裂的に安定したエピジェネティックな成分を研究するためのシステムを提供することでした。プロトコルの結論ではゼブラフィッシュおよびまたは選択組織がreseaに適した任意のアッセイによって処理することができ、ここで提供rchersが必要です。我々は、正常な代謝メモリ状態²¹に保持され高血糖によって誘発されるDNAメチル化のゲノムワイドな永続的な変更を識別するためにこのプロシージャを使用している。

我々は、I型糖尿病のこのゼブラフィッシュモデルはメタボリックメモリーを調べるため、他のモデルのシステムに比べていくつかの革新的な利点を持っていることを感じています。 1）私たちの研究のすべては 、in vivo で行うことができ、以前の高血糖魚は内因性インスリン産生の再生を通じて正常血糖値に戻すように、彼らは、外因性のインスリン注射を必要としません。したがって、これは外因性のインスリンを必要とする動物で発生する可能性が血糖コントロールの複雑スパイクや谷を回避します。 2）上記のように、前の糖尿病の状態（ すなわち、終末糖化産物および活性酸素種のマーカーの継続的な存在）から、背景刺激が除去されるため、1つは、純粋epigを調べることができますメタボリックメモリのenetic要因。それは糖尿病誘導からメタボリックメモリ検査まで約80日かかるので3）の実験を迅速に行うことができます。 4）尾鰭の再生は、実験的に非常に親しみやすいとツールの広大な配列があるどのやすい遺伝的および実験的な操作を可能にする。 5）尾鰭の再生は、メタボリックメモリーを評価するため、将来の創薬が可能になる非常にシンプルかつ定量方法を提供するものである。

Protocol

すべての手順は、（85から23までは、。研究所国立保健出版物のいかなる1985年改訂） "実験動物ケアの原則"で説明したガイドラインに従って実施され、承認ロザリンドフランクリン大学機関動物実験委員会、動物プロトコル08から19を使用しています。 この原稿で使用されている2つの重要な略語があります。 1）DMは、急性（300 mg / dl）は、高血糖状態になっている…

Representative Results

障害尾鰭再生：私の糖尿病だけでなく、ゼブラフィッシュ網膜症や腎症の既知の二次的合併症を表示するだけでなく、追加の合併症を呈するを入力します。この後の合併症は、高血糖期間の後、通常の血糖コントロールを復元した魚の代謝メモリが原因で解決しない。 図2A（コントロール）および図2B（メタボリックメモリ）72時間後に切断で捕獲された再生フィン?…

Discussion

糖尿病は、究極的にはすべての正常血糖値は薬剤介入にもかかわらず達成された後も持続し、多くの合併症につながる血管損傷につながる最初に高血糖と診断された代謝調節異常の病気、です。合併症のこの固執は代謝メモリと呼ばれ、いくつかの最近の研究では、エピジェネティックなメカニズムがこの現象に果たす役割を検討した。ここでは、急性の糖尿病やメタボリックメモリ（復元?…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Streptozocin	Sigma Aldrich	S0130
2 phenoxyethanol	Sigma Aldrich	P1126
Scalpel (size 10)	Fisher Scientific	089275A
Petri Dishes	Fisher Scientific	08-757-13
½ cc syringe, with 27 1/2 gauge needle	Fisher Scientific	305620
QuantiChrome glucose assay kit.	Bioassay Systems	DIGL-100
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014
Dissecting Microscope	Nikon	TMZ-1500	Any dissecting microscope is fine.
Camera for Imaging	Nikon	Q imaging	Any camera is suitable.
Image J software	National Institutes of Health	NIH Image
NIS Elements	Nikon		Any imaging software is suitable.