Licht Vorlieben Assay zur angeborenen und Circadian geregelten Photobehavior in Studie<em> Drosophila</em> Larven
Summary
Hier beschreiben wir eine Hell-Dunkel-Präferenz-Test für Drosophila Larve. Dieser Test liefert Informationen zur angeborenen und zirkadiane Regulierung von Licht Abtasten und Verarbeiten photobehavior.
Abstract
Licht wirkt als Signal an die Umwelt das Verhalten der Tiere auf verschiedenen Ebenen zu steuern. Die Drosophila Larven Nervensystem wird als einzigartiges Modell verwendet, um grundlegende Fragen auf, wie leicht Informationen verarbeitet und geteilt zwischen schnellen und zirkadiane Verhalten zu beantworten. Drosophila-Larven zeigen eine stereotype Vermeidungsverhalten, wenn sie dem Licht ausgesetzt. Um Licht abhängige Verhaltensweisen vergleichsweise einfachen Licht-Dunkel-Präferenz Tests angewendet werden können, zu untersuchen. Bei Wirbeltieren und Arthropoden die Nervenbahnen in der Sensorik und der Verarbeitung visueller Vorleistungen teilweise überschneiden sich mit denen Verarbeitung photic zirkadianen Informationen. Die faszinierende Frage, wie das Licht Sensing-System und der circadianen Systems interagieren zu halten Verhaltensstörungen Ausgänge koordiniert bleibt weitgehend unerforscht. Drosophila ist ein biologisches Modell auswirken, diese Fragen zu nähern, wegen einer kleinen Anzahl von Neuronen im Gehirn und die Verfügbarkeit von genetischen Werkzeuge für neuronale manipulation. Das vorgestellte Hell-Dunkel-Präferenz Assay ermöglicht die Untersuchung einer Reihe von visuellen Verhaltensweisen einschließlich circadianen Kontrolle phototaxis.
Introduction
Hier beschreiben wir eine Verhaltens-Assay basiert auf der Larven Vorliebe für dunkle (oder Licht). Larven reagieren mit einem starken und stereotypes photonegative Antwort während Nahrungssuche Stufen (L1 bis L3 früh) 1. Der Test wird das Ziel, die photophobic Verhalten der Larve bewerten und vergleicht das helle oder dunkle bevorzugt aus einer Gruppe von Larven sich frei in einer Petrischale mit Agar aufgetragen. Dieser Verhaltens-Assay bietet nicht nur Informationen über die Empfindlichkeit, Integration und zeitliche Plastizität des visuellen Systems, es weiterhin Hinweise, wie Lichtempfindlichkeit und seine Prozess wird durch den circadianen System gesteuert.
Die Drosophila Larven Auge (auch als Bowlig Orgel; BO), ist das wichtigste Organ für leichte Wahrnehmung. Jedes Auge von 12 Photorezeptoren (PR) zusammengesetzt ist, zum Ausdruck bringen acht PRs die grün-empfindlichen rhodopsin6 (rh6) und vier Fotorezeptoren Ausdruck der blau-empfindlichen rhodopsin5 (RH5) 2,3. Neben Fotorezeptoren, also Klasse IV multidendritic Neuronen, die die Larven Körper Wand bedecken, sind identifiziert worden, um schädliche Lichtintensitäten 4,5 reagieren. Es ist auch bekannt, dass der Schrittmacher Neuronen im zentralen Larven Gehirn liegt das lichtempfindliche Protein Cryptochrome (Cry), die als intrinsische Uhr blaues Licht Sensor wirkt im Gehirn 6,7 auszudrücken. Interessanterweise photophobicity von Wildtyp-Tieren zeigt eine zirkadiane Komponente zu verschiedenen Zeitpunkten im Laufe des Tages und der Nacht, wenn die Prüfung mit diesem Test. Responses to Licht der Nahrungssuche L3 Larve zeigte stärkere photophobicity im Morgengrauen und in der Abenddämmerung unteren photophobicity wenn für Hell-Dunkel-Präferenz 7 getestet. Interessanterweise nur Rh5-PRS für leichte Vermeidung erforderlich, während Rh6-PRS entbehrlich sind. Sowohl Rh5-PRS und Rh6-PRS in Zurücksetzen des molekularen Uhr durch Licht 8 beteiligt. Der Schrei Weg muss mit den anderen lichtempfindlichen Wege koordiniert werden, um eine entsprechende Verhaltens-Ausgang in die orchestrierenLaufe des Tages. Acetylcholin in PRs spielt eine wesentliche Rolle in Licht Vermeidungsverhalten sowie Mitnahme der molekularen Uhr. Blocking Acetylcholin Neurotransmission von PRS circadianen Schrittmacher Neuronen reduziert die photophobic Antwort in der Hell-Dunkel-Präferenz-Test 8. Unter Verwendung des gleichen Assay wurden zwei symmetrische Paare von Neuronen vor kurzem identifiziert, um das Licht Vorlieben des dritten Larvenstadium von Drosophila 9 wechseln. Diese beiden Paare von Neuronen während der späten Larvenstadien zu funktionieren, wenn die Tiere die Nahrung verlassen, um vermutlich finden einen geeigneten Ort Puparium-Bildung. Allerdings bleibt die Frage, wie die Sehbahn interagieren und steuern Larven visuelle Verhalten in einem zirkadianen Weise weitgehend unbeantwortet. Das Licht Vorlieben Assay ermöglicht Vergleiche zwischen circadianen Zeitpunkten fliegen Linien und circadianen Zustand unter verschiedenen Lichtverhältnissen Qualitäten. Der Test ist einfach und kostengünstig und vorbereitet hat sich als nützlich erwiesen zuvor in verschiedene Labors zu beschreiben und zu studieren Licht abgeleitet Verhalten in der Larve.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Licht bevorzugt beschriebenen Test nutzt die Larven angeborenen photobehavior. Der Test ist einfach zu schaffen, ermöglicht viele Wiederholungen bei niedrigen Kosten und liefert wertvolle Informationen über Licht sensing und Verarbeitung. Das experimentelle Paradigma ermöglicht relativ schnelle Quantifizierung, wie viele Menschen es vorziehen hell oder dunkel. Solche Vorlieben kann als Rohprodukt Prozentsätze oder alternativ als Preference Index (PREF) angezeigt werden. Die PREF wird als die Differenz von Tieren…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken unseren Kollegen am Institut für Biologie der Universität Freiburg für fruchtbare Diskussionen. Wir danken der Bloomington Stock Center für die Bereitstellung von fly Aktien. Diese Arbeit wurde finanziell unterstützt durch die Swiss National Science Foundation (PP00P3_123339) und der Velux Stiftung unterstützt SGS
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A5093-500G | 2.5%; Sigma-Aldrich, 9471 Buchs, Switzerland |
| Petri dishes | Greiner Bio-One GmbH | 633180 | 90-mm diameter; Greiner Bio-One GmbH, 4550 Kremsmeinster, Austria |
| LEDs Lamp | OSARAM | 80012 White | LED lamp, 80012 White |
| Environment Meter | PCE | PCE EM882 | Lux, Temp, RH% |
| Thermostatic cabinet | Aqua Lytic (Liebherr) | ET636-6 | |
| Light timer | Timer T | 6185.104 | 230V/50HZ (check specifications for your country) |
| Universal thermostat | Conrad | UT200 | |
| Humidifier | Boneco | ||
| Balck tape | Tesa | 5 cm | |
| Glue | Uhu | ||
| lncubator lamp | Phillips | Softtone | 5W |
| Timer clock | Ziliss | Ziliss, Switzerland | |
| Excel Software | Microsoft | Excel | |
| Origin Software 8.5 | OriginLab | ||
| Backer Yeast | Migros Switzerland | ||
| Iron support stand 17X28CM | Fisher Scientific | S47808 | |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | A6283-100ML | 20% acetic acid dilluted in H2O |
| Red light lamp | Phillips | PFE712E*8C | |
| Spatula | Fisher Scientific | 14-373-25A | |
| Power supply | EA | EA PS 2042-06B | Optional |
| Aluminium foil | Prix Coop | ||
| Heater | GOON | NSB200C | |
| Microwave Oven | Intertronic | ||
| Standard corn meal fly food | |||
| Destilled water |
References
- Sawin-McCormack, E. P., Sokolowski, M. B., Campos, A. R. Characterization and genetic analysis of Drosophila melanogaster photobehavior during larval development. J. Neurogenet. 10, 119-135 (1995).
- Sprecher, S. G., Pichaud, F., Desplan, C. Adult and larval photoreceptors use different mechanisms to specify the same Rhodopsin fates. Genes Dev. 21, 2182-2195 (2007).
- Sprecher, S. G., Desplan, C. Switch of rhodopsin expression in terminally differentiated Drosophila sensory neurons. Nature. 454, 533-537 (2008).
- Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468, 921-926 (2010).
- Diaz, N. N., Sprecher, S. G. Photoreceptors: unconventional ways of seeing. Curr. Biol. 21, R25-R27 (2011).
- Emery, P., et al. Drosophila CRY is a deep brain circadian photoreceptor. Neuron. 26, 493-504 (2000).
- Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response. Neuron. 45, 293-300 (2005).
- Keene, A. C., et al. Distinct visual pathways mediate Drosophila larval light avoidance and circadian clock entrainment. J. Neurosci. 31, 6527-6534 (2011).
- Gong, Z. F., et al. Two Pairs of Neurons in the Central Brain Control Drosophila Innate Light Preference. Science. 330, 499-502 (2010).
- Lilly, M., Carlson, J. smellblind: a gene required for Drosophila olfaction. 유전학. 124, 293-302 (1990).
- Bodenstein, D., Demerec, M. The postembryonic development of Drosophila. Biology of Drosophila. , 275-367 (1950).
- Pittendrigh, C. S. Circadian systems: Entrainment. Biological Rhythms. 4 Handbook of Behavioral Neurobiology, 95-124 (1981).
- Collins, B., Kane, E. A., Reeves, D. C., Akabas, M. H., Blau, J. Balance of Activity between LN(v)s and Glutamatergic Dorsal Clock Neurons Promotes Robust Circadian Rhythms in Drosophila. Neuron. 74, 706-718 (2012).
- Keene, A. C., Sprecher, S. G. Seeing the light: photobehavior in fruit fly larvae. Trends Neurosci. 35, 104-110 (2012).
- von Essen, A. M., Pauls, D., Thum, A. S., Sprecher, S. G. Capacity of visual classical conditioning in Drosophila larvae. Behav. Neurosci. 125, 921-929 (2011).
