Light Preference Assay til at studere Medfødte og Circadian Reguleret Photobehavior i<em> Drosophila</em> Larver
Summary
Her beskriver vi en lys-mørke præference test for Drosophila larve. Denne analyse giver oplysninger om medfødte og døgnrytmen regulering af lys sensing og behandling photobehavior.
Abstract
Lette fungerer som miljømæssig signal til at styre dyrs adfærd på forskellige niveauer. Drosophila larver nervesystem bliver brugt som et unikt model til at besvare grundlæggende spørgsmål om, hvordan lys oplysningerne behandles og deles mellem hurtige og døgnrytmen adfærd. Drosophila larver vise en stereotyp undgåelse adfærd, når de udsættes for lys. At undersøge lys afhængige adfærd sammenligneligt enkle lys og mørke præference tests kan anvendes. I hvirveldyr og leddyr nervebanerne involveret i sensing og behandling visuelle inputs delvist overlapper de behandling fotisk døgnrytmen information. Den fascinerende spørgsmål om, hvordan lyset sensing systemet og døgnrytmen systemet interagerer for at holde adfærdsmæssige udgange koordineret stort set uudforsket. Drosophila er en påvirker biologisk model til at håndtere disse spørgsmål, på grund af et lille antal af neuroner i hjernen og tilgængeligheden af genetiske værktøjer for neuronal manipulation. Den præsenterede lys-mørke præference assay tillader undersøgelse af en række visuelle adfærd, herunder døgnrytmen kontrol phototaxis.
Introduction
Her beskriver vi en adfærdsmæssig assay baseret på larvestadiet præference for mørke (eller lys). Larver reagerer med en stærk og stereotyp photonegative respons under fouragering faser (L1 til tidlig L3) 1. Assayet har til formål at vurdere den photophobic adfærd larve og sammenligner lys eller mørk præference for en gruppe af larver bevæge sig frit i en petriskål coatet med agar. Denne adfærdsmæssige analyse ikke kun indeholder oplysninger om følsomheden, integration og tidsmæssige plasticitet det visuelle system, er det endvidere tips om, hvordan lysfølsomhed og dens proces styres af døgnrytmen system.
Drosophila larver øje (også betegnet Bowlig Orgel, BO), er det vigtigste organ for lyssans. Hvert øje består af 12 fotoreceptorer (PR), otte PRs udtrykker den grønne-følsomme rhodopsin6 (RH6) og fire PRs udtrykker den blå-følsomme rhodopsin5 (RH5) 2,3. Ud over PRS, also klasse IV multidendritic neuroner, som dækker larve kropsvæggen, er blevet identificeret til at reagere på skadelige lysintensiteter 4,5. Det er også kendt, at pacemaker neuroner beliggende i den centrale Larvetilstand hjerne udtrykker det lysfølsomme protein Cryptochrome (Cry), der fungerer som ur iboende blå lyssensor i hjernen 6,7. Intriguingly photophobicity af vildtypedyr viser en døgnrytmen komponent på forskellige tidspunkter i løbet af dagen og natten, når der testes med denne analyse. Reaktionerne på baggrund af fouragering L3 larver viste stærkere photophobicity ved daggry og lavere photophobicity i skumringen, når testet for lys-mørke præference 7.. Interessant kun RH5-prs er nødvendige for let undgåelse, mens RH6-prs kan undværes. Både RH5-prs og RH6-prs er involveret i at nulstille den molekylære ur med lys 8. Den Cry vej skal koordineres med de øvrige lysfølsomme veje at orkestrere en passende adfærdsmæssig produktion iløbet af dagen. Acetylcholin i PRS spiller en afgørende rolle i lyset undgåelsesadfærd samt medrivning af den molekylære ur. Blokering acetylcholin neurotransmission fra PRS til døgnrytmen pacemaker neuroner reducerer photophobic respons i lys-mørke præference assay 8.. Anvender det samme assay, har to symmetriske par af neuroner for nylig blevet identificeret til at skifte lyset præference tredje larver instar Drosophila 9.. Disse to par neuroner kan fungere under sene larvestadier, når dyrene forlader mad til formentlig finde en passende pupariation site. Men spørgsmålet om, hvordan de visuelle veje interagere og kontrollere larve visuel adfærd på en døgnrytmen måde stort set ubesvaret. Lyset præference analysen tillader sammenligninger mellem døgnrytmen tidspunkter, flyve linjer og døgnrytmen stat under forskellige lys kvaliteter. Analysen er let forberedt og billig og har været gavnlig tidligere jegn flere laboratorier for at beskrive og studere lys afledt adfærd i larve.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lyset præference beskrevne test drager fordel af larver medfødte photobehavior. Analysen er let at bevise, tillader mange gentagelser med lave omkostninger og leverer værdifulde oplysninger om lys sensing og forarbejdning. Den eksperimentelle paradigme tillader relativ hurtig kvantificering af, hvor mange personer foretrækker lys eller mørk. Sådan præference kan vises som rå procenter eller alternativt Preference Index (PREF). Præfekturet udtrykkes som forskellen af dyr, foretrukket lys og dyr, foretrukke…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker vores kolleger på Biologisk Institut, University of Fribourg for frugtbare diskussioner. Vi takker Bloomington Stock Center for at give flyve bestande. Dette arbejde blev støttet af den schweiziske National Science Foundation (PP00P3_123339) og Velux Fonden til SGS
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A5093-500G | 2.5%; Sigma-Aldrich, 9471 Buchs, Switzerland |
| Petri dishes | Greiner Bio-One GmbH | 633180 | 90-mm diameter; Greiner Bio-One GmbH, 4550 Kremsmeinster, Austria |
| LEDs Lamp | OSARAM | 80012 White | LED lamp, 80012 White |
| Environment Meter | PCE | PCE EM882 | Lux, Temp, RH% |
| Thermostatic cabinet | Aqua Lytic (Liebherr) | ET636-6 | |
| Light timer | Timer T | 6185.104 | 230V/50HZ (check specifications for your country) |
| Universal thermostat | Conrad | UT200 | |
| Humidifier | Boneco | ||
| Balck tape | Tesa | 5 cm | |
| Glue | Uhu | ||
| lncubator lamp | Phillips | Softtone | 5W |
| Timer clock | Ziliss | Ziliss, Switzerland | |
| Excel Software | Microsoft | Excel | |
| Origin Software 8.5 | OriginLab | ||
| Backer Yeast | Migros Switzerland | ||
| Iron support stand 17X28CM | Fisher Scientific | S47808 | |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | A6283-100ML | 20% acetic acid dilluted in H2O |
| Red light lamp | Phillips | PFE712E*8C | |
| Spatula | Fisher Scientific | 14-373-25A | |
| Power supply | EA | EA PS 2042-06B | Optional |
| Aluminium foil | Prix Coop | ||
| Heater | GOON | NSB200C | |
| Microwave Oven | Intertronic | ||
| Standard corn meal fly food | |||
| Destilled water |
References
- Sawin-McCormack, E. P., Sokolowski, M. B., Campos, A. R. Characterization and genetic analysis of Drosophila melanogaster photobehavior during larval development. J. Neurogenet. 10, 119-135 (1995).
- Sprecher, S. G., Pichaud, F., Desplan, C. Adult and larval photoreceptors use different mechanisms to specify the same Rhodopsin fates. Genes Dev. 21, 2182-2195 (2007).
- Sprecher, S. G., Desplan, C. Switch of rhodopsin expression in terminally differentiated Drosophila sensory neurons. Nature. 454, 533-537 (2008).
- Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468, 921-926 (2010).
- Diaz, N. N., Sprecher, S. G. Photoreceptors: unconventional ways of seeing. Curr. Biol. 21, R25-R27 (2011).
- Emery, P., et al. Drosophila CRY is a deep brain circadian photoreceptor. Neuron. 26, 493-504 (2000).
- Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response. Neuron. 45, 293-300 (2005).
- Keene, A. C., et al. Distinct visual pathways mediate Drosophila larval light avoidance and circadian clock entrainment. J. Neurosci. 31, 6527-6534 (2011).
- Gong, Z. F., et al. Two Pairs of Neurons in the Central Brain Control Drosophila Innate Light Preference. Science. 330, 499-502 (2010).
- Lilly, M., Carlson, J. smellblind: a gene required for Drosophila olfaction. 유전학. 124, 293-302 (1990).
- Bodenstein, D., Demerec, M. The postembryonic development of Drosophila. Biology of Drosophila. , 275-367 (1950).
- Pittendrigh, C. S. Circadian systems: Entrainment. Biological Rhythms. 4 Handbook of Behavioral Neurobiology, 95-124 (1981).
- Collins, B., Kane, E. A., Reeves, D. C., Akabas, M. H., Blau, J. Balance of Activity between LN(v)s and Glutamatergic Dorsal Clock Neurons Promotes Robust Circadian Rhythms in Drosophila. Neuron. 74, 706-718 (2012).
- Keene, A. C., Sprecher, S. G. Seeing the light: photobehavior in fruit fly larvae. Trends Neurosci. 35, 104-110 (2012).
- von Essen, A. M., Pauls, D., Thum, A. S., Sprecher, S. G. Capacity of visual classical conditioning in Drosophila larvae. Behav. Neurosci. 125, 921-929 (2011).
