Lätt preferens analys för att studera Innate och Circadian Reglerad Photobehavior i<em> Drosophila</em> Larver
Summary
Här beskriver vi en ljus-mörk preferens test för Drosophila larv. Denna analys ger information om medfödda och dygnsrytm reglering av ljus avkänning och bearbetning photobehavior.
Abstract
Lätta fungerar som miljö-signal för att styra djurs beteende på olika nivåer. Den Drosophila larver nervsystemet används som en unik modell för att svara på grundläggande frågor om hur lätt information bearbetas och delas mellan snabba och dygnsrytm beteenden. Drosophila larver visa en stereotyp undvikande beteende när de utsätts för ljus. För att undersöka ljus anhörig beteenden jämförelsevis enkla ljus-mörker preferens tester kan tillämpas. I ryggradsdjur och leddjur nervbanor involverade i avkänning och bearbetning av visuell input överlappar delvis med de bearbetning fotiska dygnsrytm information. Den fascinerande frågan om hur ljuset avkänning systemet och dygnsrytm systemet samverkar för att hålla beteendemässiga utgångar samordnas fortfarande till stor del outforskat. Drosophila är ett påkörande biologisk modell för att närma sig dessa frågor, på grund av ett litet antal nervceller i hjärnan och tillgängligheten av genetiska verktyg för neuronal manipulation. Den presenterade ljus-mörker preferenser analysen möjliggör undersökning av en rad visuella beteenden inklusive dygnsrytm kontroll phototaxis.
Introduction
Här beskriver vi en beteendevetenskaplig analys baserad på larver föredrar mörk (eller ljus). Larver reagerar med en stark och stereotypa photonegative svar under födosök faser (L1 till början L3) 1. Analysen syftar till att bedöma photophobic beteendet hos larven och jämför det ljus eller mörk preferens för en grupp av larver röra sig fritt i en Petri-skål belagd med agar. Detta beteende analys inte bara ger information om känsligheten, integration och tidsmässiga plasticitet i det visuella systemet, ger det ytterligare tips om hur ljuskänslighet och dess process styrs av dygnsrytm systemet.
Den Drosophila larver öga (även benämnd Bowlig Orgel, BO), är den viktigaste organ för ljusperception. Varje öga är sammansatt av 12 fotoreceptorer (PR), åtta PRs uttrycker grön-känsliga rhodopsin6 (RH6) och fyra PRs uttrycker den blå-känsliga rhodopsin5 (RH5) 2,3. Förutom PRs, also klass IV multidendritic neuroner, som täcker larvkroppen väggen, har identifierats för att reagera på skadliga ljusintensiteter 4,5. Det är också känt att pacemaker neuroner belägna i den centrala larval hjärnan uttrycker den ljuskänsliga proteinet kryptokrom (Cry) som fungerar som klocka inneboende blå ljussensor i hjärnan 6,7. Fängslande photophobicity av vildtyp djur visar en dygnsrytm komponent vid olika tidpunkter under dagen och natten när man testar med denna analys. Svar på bakgrund av födosök L3 larv uppvisade starkare photophobicity i gryningen och lägre photophobicity i skymningen när den testades ljus-mörker preferenser 7. Intressant bara RH5-PRs krävs för lätt undvikande, medan RH6-PRs är umbärliga. Båda, RH5-PRs och RH6-PRs är involverade i att återställa den molekylära klockan genom ljus 8. Den Cry vägen måste samordnas med de andra ljuskänsliga vägar att orkestrera en lämplig beteendevetenskaplig produktionen idagens lopp. Acetylkolin i PRs spelar en viktig roll i ljuset undvikande beteende samt infångning av molekylära klockan. Blockering acetylkolin neurotransmission från PRs till dygnsrytm pacemaker nervceller minskar photophobic svaret i ljuset-mörkret föredrar analys 8. Använda samma analys, har två symmetriska par av nervceller har nyligen identifierats att växla ljuset föredrar det tredje larver instar av Drosophila 9. Dessa två par nervceller kan fungera under sena larvstadier, när djuren lämnar mat till förmodligen hitta en lämplig pupariation webbplats. Dock kvarstår frågan om hur de visuella vägar interagera och styra larver visuella beteende i en dygnsrytm sätt i stort sett obesvarad. Ljuset företräde analysen möjliggör jämförelser mellan dygnsrytm tidpunkter, flyga linjer och dygnsrytm tillstånd under olika ljus kvaliteter. Analysen är lätt förberedda och billig och har varit nyttig tidigare jagn flera laboratorier för att beskriva och studera ljuset härrör beteende i larven.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ljuset företräde beskrivna testet drar fördel av larver medfödda photobehavior. Analysen är lätt att etablera, gör många repetitioner till låg kostnad och levererar värdefull information om Ijuskännande bearbetning. Den experimentella paradigm tillåter relativt snabb kvantifiering av hur många individer föredrar ljus eller mörk. Sådana önskemål kan visas som råa procentsatser eller alternativt som Preference Index (PREF). Den PREF uttrycks som skillnaden av djur som föredragen ljus och djur som före…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar våra kollegor vid Biologiska institutionen, universitetet i Fribourg för givande diskussioner. Vi tackar Bloomington Stock Centrum för att ge flugan bestånd. Detta arbete har genomförts med finansiellt stöd från den schweiziska National Science Foundation (PP00P3_123339) och Velux stiftelsen SGS
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A5093-500G | 2.5%; Sigma-Aldrich, 9471 Buchs, Switzerland |
| Petri dishes | Greiner Bio-One GmbH | 633180 | 90-mm diameter; Greiner Bio-One GmbH, 4550 Kremsmeinster, Austria |
| LEDs Lamp | OSARAM | 80012 White | LED lamp, 80012 White |
| Environment Meter | PCE | PCE EM882 | Lux, Temp, RH% |
| Thermostatic cabinet | Aqua Lytic (Liebherr) | ET636-6 | |
| Light timer | Timer T | 6185.104 | 230V/50HZ (check specifications for your country) |
| Universal thermostat | Conrad | UT200 | |
| Humidifier | Boneco | ||
| Balck tape | Tesa | 5 cm | |
| Glue | Uhu | ||
| lncubator lamp | Phillips | Softtone | 5W |
| Timer clock | Ziliss | Ziliss, Switzerland | |
| Excel Software | Microsoft | Excel | |
| Origin Software 8.5 | OriginLab | ||
| Backer Yeast | Migros Switzerland | ||
| Iron support stand 17X28CM | Fisher Scientific | S47808 | |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | A6283-100ML | 20% acetic acid dilluted in H2O |
| Red light lamp | Phillips | PFE712E*8C | |
| Spatula | Fisher Scientific | 14-373-25A | |
| Power supply | EA | EA PS 2042-06B | Optional |
| Aluminium foil | Prix Coop | ||
| Heater | GOON | NSB200C | |
| Microwave Oven | Intertronic | ||
| Standard corn meal fly food | |||
| Destilled water |
References
- Sawin-McCormack, E. P., Sokolowski, M. B., Campos, A. R. Characterization and genetic analysis of Drosophila melanogaster photobehavior during larval development. J. Neurogenet. 10, 119-135 (1995).
- Sprecher, S. G., Pichaud, F., Desplan, C. Adult and larval photoreceptors use different mechanisms to specify the same Rhodopsin fates. Genes Dev. 21, 2182-2195 (2007).
- Sprecher, S. G., Desplan, C. Switch of rhodopsin expression in terminally differentiated Drosophila sensory neurons. Nature. 454, 533-537 (2008).
- Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468, 921-926 (2010).
- Diaz, N. N., Sprecher, S. G. Photoreceptors: unconventional ways of seeing. Curr. Biol. 21, R25-R27 (2011).
- Emery, P., et al. Drosophila CRY is a deep brain circadian photoreceptor. Neuron. 26, 493-504 (2000).
- Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response. Neuron. 45, 293-300 (2005).
- Keene, A. C., et al. Distinct visual pathways mediate Drosophila larval light avoidance and circadian clock entrainment. J. Neurosci. 31, 6527-6534 (2011).
- Gong, Z. F., et al. Two Pairs of Neurons in the Central Brain Control Drosophila Innate Light Preference. Science. 330, 499-502 (2010).
- Lilly, M., Carlson, J. smellblind: a gene required for Drosophila olfaction. 유전학. 124, 293-302 (1990).
- Bodenstein, D., Demerec, M. The postembryonic development of Drosophila. Biology of Drosophila. , 275-367 (1950).
- Pittendrigh, C. S. Circadian systems: Entrainment. Biological Rhythms. 4 Handbook of Behavioral Neurobiology, 95-124 (1981).
- Collins, B., Kane, E. A., Reeves, D. C., Akabas, M. H., Blau, J. Balance of Activity between LN(v)s and Glutamatergic Dorsal Clock Neurons Promotes Robust Circadian Rhythms in Drosophila. Neuron. 74, 706-718 (2012).
- Keene, A. C., Sprecher, S. G. Seeing the light: photobehavior in fruit fly larvae. Trends Neurosci. 35, 104-110 (2012).
- von Essen, A. M., Pauls, D., Thum, A. S., Sprecher, S. G. Capacity of visual classical conditioning in Drosophila larvae. Behav. Neurosci. 125, 921-929 (2011).
