Génération de haute qualité Immunoprécipitation de la chromatine Patron de l'ADN pour le séquençage à haut débit (ChIP-seq)

Summary

La combinaison de l'immunoprécipitation de la chromatine et le séquençage ultra-haut débit (chip-seq) permet d'identifier et de cartographier les interactions protéine-ADN dans une lignée de tissu ou de cellule donné. Décrit est de savoir comment générer un modèle de puce de haute qualité pour le séquençage ultérieur, en utilisant l'expérience avec le facteur de transcription TCF7L2 comme un exemple.

Abstract

ChIP-séquençage (ChIP-seq) méthodes offrent directement couverture du génome entier, où la combinaison immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) et le séquençage massivement parallèle peut être utilisé pour identifier le répertoire de séquences d'ADN de mammifères liés par des facteurs de transcription in vivo. "La nouvelle génération" technologies de séquençage du génome fournissent 1-2 ordres de grandeur dans l'augmentation de la quantité de séquence qui peut être rentable généré plus anciennes technologies permettant ainsi des méthodes ChIP-Seq pour fournir directement la couverture du génome entier pour le profilage efficace des mammifères interactions protéine-ADN.

Pour les approches ChIP-Seq succès, il faut générer une matrice d'ADN de Morceau de qualité afin d'obtenir les meilleurs résultats de séquençage. La description est basée sur l'expérience avec le produit protéique du gène le plus fortement impliquée dans la pathogenèse du diabète de type 2, à savoir le facteur de transcription facteur de transcription 7-like 2 (TCF7L2). Ce facteur a également été impliqué dans divers cancers.

Décrit est de savoir comment générer une matrice d'ADN de puce de haute qualité issu de la lignée de cellules de carcinome colorectal, HCT116, afin de construire une carte à haute résolution par séquençage de déterminer les gènes liés par TCF7L2, donner un nouvel aperçu de son rôle clé dans la pathogenèse des traits complexes.

Introduction

Depuis de nombreuses années, il ya eu un besoin non satisfait pour identifier l'ensemble des gènes liés et réglementée par une protéine échelle du génome entier, en particulier compte tenu de ceux de la classe de facteur de transcription.

Odom et al. ¹ utilisé immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) combiné avec des puces de promoteurs afin d'identifier systématiquement les gènes occupées par des régulateurs de transcription pré-spécifiés dans le foie humain et îlots pancréatiques. Par la suite, Johnson et al. ² mis au point un test d'immunoprécipitation de la chromatine à grande échelle basée sur le séquençage direct ultra haut débit ADN (ChIP-seq) afin de cartographier en détail les interactions protéine-ADN dans l'ensemble de génomes de mammifères. En cas de test, ils ont cartographié in vivo la liaison du facteur de silencieux neurones restrictive (CRSN) à 1946 endroits dans le génome humain. Les données affichées résolution forte de position de reliure (+ 50 paires de bases), ce qui a facilité à la fois le iconsolation de motifs et de l'identification des motifs CRSN contraignantes. Ces données ChIP-Seq également eu une grande sensibilité et de la spécificité et de la confiance statistique (p <10 ^-4), propriétés qui sont importantes pour déduire de nouvelles interactions candidats.

Robertson et al. ³ également utilisé ChIP-seq afin de cartographier STAT1 cibles dans l'interféron γ-(IFN-γ)-stimulés et non stimulés cellules HeLa S3 humains in vivo. Par Chip-Seq, avec 15,1 et 12,9 millions de séquence cartographiée unique lit, et un taux de fausses découvertes estimée à moins de 0.001, ils ont identifié 41 582 et 11 004 régions STAT1-putatifs de liaison dans les cellules stimulées et non stimulées, respectivement. Sur les 34 loci connus pour contenir l'interféron STAT1 sensible liaison ^4-8 sites ChIP-seq trouvé 24 (71%). Objectifs ChIP-Seq ont été enrichies en séquences similaires à connaître STAT1 motifs de liaison. Les comparaisons avec les données de la puce deux-PCR existants définit suggéréque la sensibilité ChIP-seq se situait entre 70% et 92% et la spécificité était d'au moins 95%. En outre, il était clair que ChIP-seq offre à la fois une faible complexité analytique et une sensibilité qui augmente avec la profondeur de séquençage.

Alors que les technologies de séquençage tel, Génome "nouvelle génération" offrent 1-2 ordres de grandeur dans l'augmentation de la quantité de séquence qui peut être rentable généré plus anciennes technologies ^9. Méthodes ChIP-Seq fournissent donc directement couverture du génome entier pour le profilage efficace des interactions protéine-ADN de mammifères ^3.

En 2006, une forte association des variants du facteur de transcription 7-like 2 (TCF7L2) gène du diabète de type 2 a été découvert ^10. D'autres chercheurs ont déjà répliqué indépendamment de cette constatation dans différentes ethnies et, curieusement, depuis les premières études d'association génomique échelle du diabète de type 2 publiés dans Nature ^11,12 </splace>, Science ^13-15 et ailleurs ^16,17, la plus forte association était en effet avec TCF7L2, ce qui est maintenant considéré comme le résultat génétique le plus important dans le diabète de type 2 à ce jour ^18-20. En outre, TCF7L2 a été liée à un risque de cancer ^21,22, en effet, ce lien est devenu plus évident lorsque le locus 8q24 révélé par Génome larges études d'association d'un certain nombre de cancers, y compris les carcinomes colorectaux, s'est révélée être en raison d'une extrême amont TCF7L2 élément contraignant de conduire la transcription MYC ^23,24. En tant que tel, il ya un grand intérêt dans la détermination des gènes en aval régulés par ce facteur de transcription clé.

Basé sur l'expérience avec TCF7L2 comme un exemple de la méthodologie, ce document décrit comment générer une matrice d'ADN de Morceau de qualité. Puce a été effectuée de la lignée cellulaire de carcinome colorectal, HCT116, pour le séquençage ultérieur afin de construire un haut-résolcarte ution des gènes liés par TCF7L2 ²⁵ dans un effort pour donner un meilleur aperçu de son rôle clé dans la pathogenèse de traits complexes.

Protocol

1. Cross-link chromatine Cultiver les cellules dans des boîtes de culture cellulaire 100x20mm. La quantité de cellules peut varier de 1 à 10 millions de cellules par boîte selon le type de cellule. Environ 2 millions de cellules est suffisant pour une immunoprécipitation. Cellules Cross-Link 1% de formaldéhyde pendant 10 min à température ambiante avec bascule occasionnelle. Étancher la réticulation en ajoutant une concentration finale de 125 mM de glycine et incuber pendant 5 mi…

Representative Results

Une fois la chromatine a été traité par ultrasons et ont été traités à la RNase et protéinase, les échantillons analysés sur le gel à 2% d'agarose doivent présenter un frottis avec la majeure partie de l'ADN à la taille désirée. Si plusieurs cycles différents sont testés, une diminution progressive de la taille doit être considéré comme le nombre de cycles de hausse (figure 2). Après avoir terminé la partie d'immunoprécipitation du protocol…

Discussion

Il est désormais possible d'effectuer l'ensemble du génome profil de l'association des interactions protéine-ADN en utilisant ChIP-seq, comme cela a été récemment démontrée avec d'autres facteurs de transcription ^2,3. La clé d'un résultat de séquençage réussie est la génération d'un modèle chromatine de l'ADN d'immunoprécipitation de haute qualité.

Une fois la matrice d'ADN a été généré et déterminé à être enrichi de m…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104
EZ-ChIP Kit	Millipore	17-371
GoTaq Hot Start Polymerase	Promega	M5001
Misonix Sonicator	Qsonica	XL-2000
NanoDrop 1000 Spectrophotometer	Thermo-Scientific
			Positive control primer sequences (TCF7L2-1) Forward- 5′-TCGCCCTGTCAATAATCTCC-3′ Reverse- 5′-GCTCACCTCCTGTATCTTCG-3′ Negative control primer sequences (CTRL-1) Forward-5′-ATGTGGTGTGGCTGTGATGGGAAC-3′ Reverse- 5′-CGAGCAATCGGTAAATAGGTCTGG-3′