Generación de Plantilla ADN Immunoprecipitation cromatina alta calidad para la secuenciación de alto rendimiento (chip-ss)

Summary

La combinación de inmunoprecipitación de la cromatina y la secuenciación de ultra-alto rendimiento (chip-ss) puede identificar y mapear las interacciones proteína-ADN en un tejido o línea celular dada. Contorno es cómo generar una plantilla de chip de alta calidad para la posterior secuenciación, utilizando la experiencia con el factor de transcripción TCF7L2 como un ejemplo.

Abstract

Métodos de secuenciación (chip-chip-ss) ofrecen directamente la cobertura de todo el genoma, en donde la combinación de inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) y secuenciación masiva en paralelo puede ser utilizado para identificar el repertorio de secuencias de ADN de mamíferos vinculados por factores de transcripción en vivo. "La próxima generación de" tecnologías de secuenciación del genoma proporcionan 1-2 órdenes de magnitud aumento en la cantidad de secuencia que puede ser rentable generado más viejas tecnologías lo que permite métodos de chip-ss para proporcionar directamente la cobertura de todo el genoma de perfiles efectiva de los mamíferos interacciones proteína-DNA.

Para exitosos enfoques chip-ss, hay que generar chip molde de ADN de alta calidad para obtener los mejores resultados de secuenciación. La descripción se basa en la experiencia con el producto de proteína del gen más fuertemente implicados en la patogénesis de la diabetes tipo 2, a saber, el factor de transcripción factor de transcripción 7-como 2 (TCF7L2). Este factor también ha sido implicado en varios tipos de cáncer.

Contorno es cómo generar plantilla de chip de ADN de alta calidad derivada de la línea celular de carcinoma colorrectal, HCT116, con el fin de construir un mapa de alta resolución a través de la secuenciación para determinar los genes vinculados por TCF7L2, dando más detalles en a su papel clave en la patogénesis de rasgos complejos.

Introduction

Durante muchos años ha habido una necesidad no satisfecha para identificar el conjunto de genes vinculados y regulado por una proteína dada genoma de ancho, en particular los de la clase de factor de transcripción.

Odom et. Al ¹ utiliza la cromatina immunoprecipitation (CHIP) en combinación con el promotor microarrays para identificar sistemáticamente los genes ocupados por reguladores transcripcionales pre-especificados en el hígado humano y los islotes pancreáticos. Posteriormente, Johnson et al. ² desarrollaron un ensayo de inmunoprecipitación de cromatina a gran escala basada en la secuenciación directa de ultra alto rendimiento de ADN (chip-ss) para asignar globalmente las interacciones proteína-ADN a través de todo los genomas de mamíferos. Como caso de prueba, se asignan in vivo la unión del factor silenciador restrictivo neuronal (NRSF) a 1.946 localizaciones en el genoma humano. Los datos muestran una nítida resolución de la posición de encuadernado (+ 50 pares de bases), lo que facilitó la isolation de motivos y la identificación de motivos NRSF vinculantes. Estos datos chip-seq también tenían una alta sensibilidad y especificidad y la confianza estadística (P <10 ^-4), propiedades que son importantes para inferir nuevas interacciones candidatos.

Robertson et al. ³ también se utiliza chip-ss con el fin de asignar STAT1 objetivos en interferón-γ (IFN-γ)-estimulado y células HeLa S3 humanos no estimulados in vivo. Por chip-ss, con 15,1 y 12,9 millones de secuencia asignado únicamente lee, y se estima una tasa de falso descubrimiento de menos de 0.001, se identificaron 41.582 y 11.004 supuestos regiones STAT1 vinculante en células estimuladas y no estimuladas, respectivamente. De los 34 loci se sabe que contienen STAT1 que responden al interferón vinculante sitios ^4-8, chip-ss encontraron 24 (71%). Objetivos chip-ss fueron enriquecidos en secuencias similares a conocidos STAT1 vinculante motivos. Las comparaciones con los datos de dos chip-PCR existentes establece sugirióque la sensibilidad chip-ss fue entre 70% y 92% y la especificidad fue de al menos 95%. Además, estaba claro que el chip-ss ofrece tanto de baja complejidad analítica y la sensibilidad que aumenta con la secuenciación de profundidad.

Como las tecnologías de secuenciación tal, genoma "de nueva generación" ofrecen 1-2 órdenes de magnitud aumento en la cantidad de secuencia que puede ser rentable generado más viejas tecnologías ^9. Por lo tanto, los métodos de chip-ss proporcionan directamente la cobertura de todo el genoma de perfiles eficaz de mamíferos interacciones proteína-ADN ^3.

En 2006, una fuerte asociación de variantes en el factor de transcripción 7-like 2 (TCF7L2) gen con la diabetes tipo 2 fue descubierto ^10. Otros investigadores ya han replicado este hallazgo independiente en diferentes etnias y, curiosamente, a partir de los primeros estudios de asociación de todo el genoma de la diabetes tipo 2, publicados en la revista Nature ^11,12 </sa>, Ciencia ^13-15 y en otros ^16,17, la asociación más fuerte fue hecho con TCF7L2, lo que ahora se considera el hallazgo genético más importante en la diabetes tipo 2 al día ^18-20. Además, TCF7L2 se ha relacionado con el riesgo de cáncer ^21,22, de hecho, esta conexión se hizo más evidente cuando el locus 8q24 revelado por estudios de asociación en todo el genoma de un número de cánceres, incluyendo carcinomas colorrectales, se demostró que era debido a un extremo aguas arriba TCF7L2 elemento de unión a conducir la transcripción de MYC ^23,24. Como tal, hay un gran interés en la determinación de los genes aguas abajo regulados por este factor de transcripción clave.

Basándose en la experiencia con TCF7L2 como un ejemplo de la metodología, este documento describe cómo generar chip plantilla de ADN de alta calidad. Chip se llevó a cabo en la línea celular de carcinoma colorrectal, HCT116, para la posterior secuenciación para construir una alta resollución mapa de los genes vinculados por TCF7L2 ²⁵ en un esfuerzo para producir una mayor comprensión en a su papel clave en la patogénesis de los rasgos complejos.

Protocol

1. Cross-link cromatina Se cultivan las células en placas de cultivo celular 100x20mm. La cantidad de células puede variar de 1 a 10 millones de células por plato dependiendo del tipo de célula. Aproximadamente 2 millones de células es suficiente para una inmunoprecipitación. Células Cross-link en el 1% de formaldehído durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación ocasional. Se inactiva la reticulación mediante la adición de una concentración final de 125 mM de glicin…

Representative Results

Una vez que la cromatina se ha sonicó y han sido tratados con RNasa y proteinasa, las muestras se ejecutan en el gel de agarosa al 2% deben presentar un frotis con la mayor parte del ADN en el tamaño deseado. Si se prueban varios ciclos diferentes, una disminución gradual en el tamaño debe ser visto como el número de ciclos de aumento (Figura 2). Después de completar la porción de inmunoprecipitación del protocolo el enriquecimiento o bien se puede comprobar por PCR …

Discussion

Ahora es posible llevar a cabo un genoma en todo el perfil de asociación interacciones proteína-ADN utilizando chip-ss, como se ha demostrado muy recientemente con otros factores de transcripción ^2,3. La clave para un resultado exitoso secuenciación es la generación de una cromatina immunoprecipitation molde de ADN de alta calidad.

Una vez que la plantilla de ADN se ha generado y se cercioró de ser enriquecido adecuada, uno puede entonces tomar en preparación biblioteca par…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104
EZ-ChIP Kit	Millipore	17-371
GoTaq Hot Start Polymerase	Promega	M5001
Misonix Sonicator	Qsonica	XL-2000
NanoDrop 1000 Spectrophotometer	Thermo-Scientific
			Positive control primer sequences (TCF7L2-1) Forward- 5′-TCGCCCTGTCAATAATCTCC-3′ Reverse- 5′-GCTCACCTCCTGTATCTTCG-3′ Negative control primer sequences (CTRL-1) Forward-5′-ATGTGGTGTGGCTGTGATGGGAAC-3′ Reverse- 5′-CGAGCAATCGGTAAATAGGTCTGG-3′