Summary
Descriviamo i protocolli per i nostri arteriosclerois innesto del mouse (GA) modelli che comportano l'interposizione di un segmento di vaso del mouse in un destinatario dello stesso ceppo inbred. Con backcrossing ulteriori cambiamenti genetici nella nave cedente, il modello è in grado di valutare l'effetto di geni specifici in GA.
Abstract
Arteriosclerois Graft (GA), chiamati anche vasculopatia allotrapianto, è una lesione patologica che si sviluppa nel corso di mesi o anni di organi trapiantati caratterizzate da diffusa, stenosi circonferenziale dell'intero albero vascolare del trapianto. Il componente più critico di GA patogenesi è la proliferazione di cellule muscolari lisce-simili all'interno dell'intima. Quando un segmento di arteria coronaria umana è interposto nel aortae infra-renale di topi immunodeficienti, le intimas potrebbero essere espandono in risposta a cellule T umane adoptively trasferiti al donatore allogenico un'arteria o esogena umana IFN-γ in assenza di cellule T umane. Interposizione di una aorta topo da un ceppo in un altro ceppo ricevente topo è limitato come modello per rigetto cronico nell'uomo perché la risposta cellulo-mediata rigetto acuto in questo modello di topo elimina completamente tutte derivate dal donatore cellule vascolari del trapianto entro due-tre settimane. Abbiamo recentemente sviluppato due nuovi mOuse modelli per aggirare questi problemi. Il primo modello prevede l'interposizione di un segmento del vaso da un topo maschio in una femmina destinatario dello stesso ceppo inbred (C57BL/6J). Rigetto in questo caso è diretto solo contro antigeni di istocompatibilità minori codificate dal cromosoma Y (presente nel maschio, ma non la femmina) e la risposta di rifiuto che ne deriva è sufficientemente indolente di conservare le cellule muscolari lisce derivate dal donatore per diverse settimane. Il secondo modello prevede l'interposizione di un segmento di arteria da un tipo donatore C57BL/6J topo selvatico in un topo ospite dello stesso ceppo e genere che manca il recettore per IFN-γ seguita da somministrazione di topo IFN-γ (distribuito mediante infezione del mouse fegato con un vettore adenovirale. Non c'è rigetto in questo caso come donatore e topi riceventi sono dello stesso ceppo e genere ma donatori cellule muscolari lisce proliferano in risposta alla citochina mentre ospitanti cellule derivate, privo recettore perquesta citochina, non rispondono. Con backcrossing ulteriori cambiamenti genetici nella nave cedente, entrambi i modelli possono essere utilizzati per valutare l'effetto di geni specifici sulla progressione GA. Qui, descriviamo protocolli dettagliati per i nostri modelli di mouse GA.
Introduction
Arteriosclerois Graft (GA), chiamati anche vasculopatia allotrapianto, è una lesione patologica che si sviluppa nel corso di mesi o anni di organi trapiantati caratterizzate da diffusa, stenosi circonferenziale dell'intero albero vascolare dell'innesto 7. Fasi precoci possono causare stenosi eccentriche e focale che sono più evidenti nelle arterie, quindi più da vicino assomiglia stenosi visto in aterosclerosi convenzionale. La perdita lume dei vasi dell'innesto risultati espansione intimale causa di infiltrazioni di cellule T e macrofagi ospite e soprattutto per l'accumulo di matrice extracellulare e di muscolo liscio-come cellule originati da trapianto, host o entrambi 5, 13, 19, che è insufficientemente compensata da esterno nave rimodellamento. In allotrapianti cardiaci, le lesioni clinicamente più significative sono quelle nelle arterie coronarie e epicardiche intramiocardica. In definitiva, GA delle arterie coronarie provoca insufficienza cardiaca ischemica. GA è la principale causa di ritardo gr cardiacoperdita di poppa. Le stenosi di GA fermano le linee di sutura, che implica fortemente la risposta dell'ospite a alloantigeni innesto nella sua patogenesi e che ci porta a classificare GA come una forma di rigetto cronico 3. Tuttavia, altre forme di lesione arteriosa può aumentare il rischio di GA, sia attraverso aumentando il carico netto di lesioni o intensificando e / o modulare la risposta allo immune. La cella (CE) rivestimento endoteliale delle arterie innesto viene conservata in GA umano e le regioni più superficiali del intimale adiacente al rivestimento CE è il sito più pesantemente infiltrati da host-derived IFN-γ-producono cellule T e macrofagi 11; nella alcuni pazienti GA è associato con lo sviluppo di alloanticorpi donatore-specifici che si legano a innesto EC 16 ma i vasi mostrano poca prova della necrosi fibrinoide che è caratteristica di rigetto acuto anticorpo-mediata 11.
Il componente più critico di GA patogenesi è laproliferazione di cellule muscolari lisce-simili all'interno del intima, se questo processo può essere arrestato, GA è improbabile a progredire. Precedente lavoro del nostro gruppo aveva dimostrato che intimas di segmenti di arterie coronariche umane interposti nella aortae infra-renale di topi immunodeficienti espandono in risposta a cellule T umane allogeniche adoptively trasferiti al donatore arteria e che questo processo potrebbe essere inibito neutralizzando umana IFN- γ 18. Inoltre esogeno IFN-γ umano potrebbe causare intimale (e mediale) cellule muscolari lisce (VSMC) proliferazione vascolare in questi innesti arteriosi in assenza di cellule umane T 15, 17. (E 'importante notare che uomo e topo IFN-γ non attraversare specie, escludendo gli effetti indiretti sulla ospite del mouse in questo sistema sperimentale). Questi modelli di topo umanizzato hanno il vantaggio di ricapitolare cellule T umano / interazioni delle cellule vascolari e il intimale Le lesioni sono in gran parte costituiti da cellule umane (cioè graft-derivato),Come è stato osservato in campioni clinici, ma non ricapitolare appieno la situazione clinica perché ignorano il ruolo dei macrofagi ospitanti e forse altri tipi di cellule coinvolte nelle lesioni trapianti clinici. Un modello convenzionale topo di questo processo potrebbe teoricamente risolvere questo problema, integrando le limitazioni del modello umanizzato coinvolgendo un sistema completo immunitario ospite e fornendo l'ulteriore vantaggio di permettere la potenza di approcci genetici topo da applicare a GA. I due modelli di mouse più diffusi riguardano il trapianto di cuore eterotopico e arteria trapianto ortotopico 1. Le lesioni che si sviluppano nelle arterie dei trapianti di cuore eterotopico sono in gran parte costituiti da cellule ospiti, probabilmente di origine midollare, mentre le cellule intimale delle arterie a innesti cardiaci umani sono prevalentemente di origine innesto 5, 13, 19. Questa è una distinzione importante, che ha portato a sviluppare modelli alternativi del mouse. Interposizione diuna aorta topo da un ceppo in un altro ceppo ricevente mouse è ancora più limitata come modello per rigetto cronico nell'uomo perché la risposta cellulo-mediata rigetto acuto in questo modello di topo elimina completamente tutte le cellule vascolari derivate dal donatore dal trapianto entro due-tre 19 settimane. Di conseguenza, le successive variazioni visti nel segmento del vaso interposto sono solo una risposta di cellule ospiti che hanno ripopolato il decellularized nave patibolo, creando una situazione estremamente artefatta di scarsa rilevanza come modello per i cambiamenti di vasi di innesto che si verificano nella clinica. Abbiamo recentemente sviluppato due nuovi modelli di mouse per aggirare questi problemi 21. Il primo modello prevede l'interposizione di un segmento del vaso da un topo maschio in una femmina destinatario dello stesso ceppo inbred (C57BL/6J). Il secondo modello prevede l'interposizione di un segmento di arteria da un tipo donatore C57BL/6J topo selvatico in un topo ospite dello stesso ceppo e genere che manca della receptor per IFN-γ (IFN-γR-KO), seguito da somministrazione di IFN-γ del mouse (distribuito mediante infezione del fegato del topo con un vettore adenovirale. Qui, descriviamo protocolli dettagliati ed i vantaggi dei nostri modelli murini GA.
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Protocol
Topo allotrapianto e singenico modello di trapianto di innesto
Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dalla cura degli animali istituzionale e comitati uso di Yale. Per il modello di allotrapianto, segmenti di aorta toracica da maschio, 4-5 settimane vecchia WT (C57BL/6J) o IFN-γR-KO sono stati interposti in aorta addominale del destinatario femminile, 8-12 settimane di età WT utilizzando un end-to -end microchirurgico tecnica anastomotica (vedi successivo per i dettagli). Per il modello innesto singenico, segmenti di aortae toracica da Male, la settimana 4-5 topi WT sono stati interposti nella aortae addominale del maschio, 8-12 settimane di età IFN-γR1-KO con una soluzione end-to-end microchirurgico tecnica anastomotica. Dopo 1 settimana dopo l'intervento, gli animali sono stati inoculati iv con Ad5.CMV-topo IFN-γ o Ad5.CMV-LacZ (Qbiogene) a 1 x 10 9 PFU. Siero del mouse IFN-γ livelli sono stati misurati mediante test ELISA (eBioscience) a 1 e 5 settimane dopo la somministrazione di adenovirus. Taluni animali hanno ricevuto BrdU(Sigma-Aldrich) a 100 mg / kg sc per 2 settimane prima del sacrificio.
End-to-end microchirurgica tecnica anastomotica (video verranno intraprese per questa parte):
1. Procedura donatore
- Anestetizzare i topi donatori con iniezioni intraperitoneali di ketamina (50 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg).
- Dopo aver verificato l'anestesia adeguata, mettere i topi donatori sotto il microscopio operatorio a X8-30 ingrandimento su un vassoio in posizione supina, e l'uso di iodio Prep Pad e alcol Prep Pad per la preparazione della parete toracica.
- Incidere la parete toracica anteriore attraverso le nervature e il diaframma per esporre il cuore.
- Aprire l'atrio destro, iniettare 10 ml di eparina (100 U / ml) di soluzione salina nel ventricolo sinistro per svuotare i topi utilizzando una siringa da 10 ml con un ago calibro 25.
- Resecare cuore e polmoni per esporre l'intera lunghezza dell'aorta toracica.
- Sezionare attentamente l'aorta toracica per minimizzare il trauma diretto, while identificare, legare e sezionare i rami legname che utilizzano 11-0 sutura vicino l'aorta.
- Una volta che l'aorta toracica è libera dal tessuto circostante, accise tutta aorta toracica per il trapianto.
- Lavare l'estremità del taglio dell'aorta donatore con eparina (100 U / ml) di soluzione salina, e memorizzarlo nella stessa soluzione sul ghiaccio (fino a 6 ore) fino al trapianto.
2. Procedura destinatario
- Iniettare i topi riceventi con ip ketoprofene (5 mg / kg) per l'analgesia, e thenanesthetize i topi con ketamina ip (50 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg). I topi riceventi sono profondamente anestetizzati entro 10 minuti per una durata di 60-90 min. Durante l'intervento, il livello di anestesia viene valutata ogni 15 min da pizzicare la parete addominale anteriore o il piede con pinze. Se l'animale reagisce agli stimoli nocivi in qualsiasi momento durante l'intervento, un'ulteriore dose di chetamina e xilazina (1/4 o 1/3 della dose originale) sarà somministrato per sc o im
- Dopo aver verificato l'anestesia adeguata, radere il pelo nella parete addominale anteriore con un rasoio elettrico, pulire la pelle con Iodio Prep Pad e alcol Prep Pad, coprire gli occhi con pomata oftalmica. Durante la chirurgia, le seguenti tecniche asettiche saranno utilizzati per le operazioni di pulizia, compreso il tavolo operatorio con 10% di candeggina, indossando guanti sterili e utilizzando strumenti di microchirurgia sterilizzati (strumenti sterilizzati per l'inizio dell'operazione, vetro poi caldo bead-sterilizzato strumenti tra i più operazioni, ecc.)
- Collocare i topi riceventi al microscopio operativo ad un ingrandimento di X8-30 su un vassoio in posizione supina.
- Incidere la parete addominale sulla linea mediana da xifoidea al pube, e diffondere la parete addominale le superfici usando un micro-retrattore per esporre la cavità addominale.
- Ritrarre l'intestino superiormente e avvolgere con una garza inumidita con soluzione fisiologica. I topi riceventi soffrano il freddo da perdita di heaT attraverso intestino esternalizzati. È importante mantenere il calore animale. Tuttavia, il bordo del riscaldamento non viene usato durante la chirurgia come modesta ipotermia è utile per prevenire lesioni spinali durante l'occlusione del flusso ematico aortico e vi è poco efficiente trasferimento di calore con il flusso di sangue assente alla metà inferiore del corpo topi.
- Spostare gli organi riproduttivi inferiormente, avvolgere le zone addome di topi riceventi con garza salina-soluzione-inumidito, e usarlo per ritrarre il retto al lato destro dell'addome. I tessuti esposti sono irrigati periodicamente con soluzione salina durante il trapianto.
- Sezionare senza mezzi termini un segmento di aorta sottorenale tra il vaso renale prossimale e distale biforcazione aortica e separare dalla vena cava inferiore (IVC) con attenzione.
- Identificare e legare tutti i piccoli rami provenienti da questo segmento di aorta addominale utilizzando 11-0 poliammide monofilamento sutura.
- Cross-clamp il segmento isolato di unaaorta bdominal utilizzando due morsetti vascolari proximately 5 millimetri a parte, uno ad ogni estremità.
- Transezione l'aorta addominale tra il morsetto con taglienti micro-forbici per creare i siti anastomosi.
- Resecare un piccolo segmento di aorta addominale (fino a 0,4 mm di lunghezza) da una estremità tagliata di transected destinatario aorta per accogliere il graft aortico donatore.
- Lavare i segmenti aortici tra i morsetti utilizzando soluzione fisiologica con eparina per rimuovere il sangue residuo. I segmenti aortici tra morsetti e l'innesto aortico donatore sono irrigati periodicamente con eparina (100 U / ml) di soluzione salina (fino a 40 ml / kg) durante anastomosi.
- Transezione entrambi i lati del donatore aorta con taglienti micro-forbici per creare un innesto segmento di 2,5 mm di lunghezza per il trapianto.
- Posizionare l'innesto aortico donatore in posizione ortotopico, anastomose estremità prossimale e distale del donatore dell'innesto a fine taglio prossimale e distale del destinatario dell'aorta addominale, rispettivamente, con un fine-tmodello o-end utilizzando 11-0 poliammide monofilamento sutura.
- Per le continue suture, posizionare i punti di sutura soggiorno a 3 e 9 posizioni in primo luogo. Tra due suture a ogni lato del graft, anastomose entrambi i bordi tagliati in 3-4 punti utilizzando le suture in esecuzione, e legare le suture in esecuzione per rimanere suture con un doppio nodo. Poiché i due strati di chiusura sono continui, il rischio di deiscenza è aumentato. L'innesto aortico donatore dovrebbe essere di lunghezza adeguata per collegare all'estremità di taglio prossimale e distale del destinatario della aorta addominale.
- Per i punti staccati, costruire quattro anastomosi a 3 e 9 posizioni in entrambi i lati del trapianto in primo luogo, e anastomose entrambi i bordi tagliati in 3-4 punti di sutura tra due punti di sutura soggiornare in ogni lato del trapianto.
- Rilasciare il morsetto distale per consentire il flusso retrogrado in trapianto, identificare le sedi di sanguinamento e fare punti aggiuntivi entro 3 minuti.
- Dopo aver accertato l'emostasi soddisfacente, allentare il morsetto prossimale.
- Confermare la pervietà dell'innesto dalla presenza di pulsazione vigorosa l'innesto e il segmento adiacente prossimale dell'aorta addominale nativa, in particolare nel segmento adiacente distale dell'aorta addominale e mesenterica inferiore. Considerare trombosi in siti anastomotiche se la pulsazione diminuisce nel giro di pochi minuti dopo il ripristino del flusso sanguigno.
- Restituire l'intestino nella cavità addominale.
- Suturare chiudere la parete addominale utilizzando 5-0 sutura in nylon strato muscolare e lo strato della pelle, rispettivamente.
- Mettere i topi riceventi in una gabbia pulita sulla sommità di una piastra elettrica, e aspettare 1-2 ore per i topi a riprendere coscienza e recuperare da anestesia. È importante mantenere un'adeguata animale calore durante il recupero. Tenere i topi in gabbia caldo e asciutto prima di scia animale dall'anestesia.
- Valutare la funzione motoria degli arti posteriori dopo il recupero topi, e di nuovo il secondo giorno. Un intervento chirurgico di trapianto di successo verrà confermato if nessuna disfunzione degli arti posteriori è osservata in topi riceventi il secondo giorno.
- Amministrare i topi riceventi con ketoprofene in acqua potabile (5 mg / kg / d = 27 ug / ml in acqua potabile) per 48 ore. Se alcuni topi riceventi soffrono di dolore non trattato dagli analgesici postoperatori come dimostra la perdita di mobilità, il mancato sposo, anormale ricompattato postura, ecc, saranno sacrificati. Gli animali saranno sacrificati a fine punti predefiniti dopo 1-60 giorni.
Analisi Graft
Innesti di arteria del trapianto sono stati acquistati a 4 settimane e innesti a modello dell'innesto singenico erano sei settimane dopo l'intervento (5 settimane dopo l'infezione virale) e analizzati mediante tecniche istologiche standard per Elastica-van Gieson (EVG) colorazione ematossilina eosina (HE) colorazione e colorazione di immunofluorescenza. Foto sono state scattate con un sistema di microscopia di immunofluorescenza (Zeiss). Conteggio delle cellule di nuclei circondati da immunoistochimica positiva è stata eseguireed in alto ingrandimento e in media da 5 sezioni per ogni innesto. Le misurazioni dell'area innesto del lume (entro l'endotelio), intimale (tra la lamina elastica interna ed endotelio, IEL), media (tra il IEL e della lamina elastica esterna, EEL), spessore di parete (tra la lamina elastica esterna ed endotelio) e vaso intero (entro l'anguilla) sono stati calcolati da 5 seriali sezioni, 150 micron a parte per ogni innesto, utilizzando l'analisi computer-assistita e NIH Immagine 1.60 ( http://rsbweb.nih.gov/nih-image ).
L'analisi statistica
Tutti i dati sono espressi come media ± SEM. Due code, t test appaiati e un due vie ANOVA = analisi sono state eseguite utilizzando il programma software Prism (GraphPad Software). Differenze con p <0,05 sono stati considerati come statisticamente significativi.
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Representative Results
Topo modello allotrapianto arteriosclerosi (GA): In questo modello, un donatore maschio aorta viene trapiantato nel ricevente femmina modo che l'host induce risposte allo-mediate da cellule T alloreattive contro un antigene Y minore (il maschio-specifico minore di istocompatibilità HY) espressi sul l'innesto 12, ed a sua volta prodotta da cellule T γ-IFN azionamenti VSMC proliferazione 20 come osservato in altri modelli di trapianto allogenico 2, 6, 8-10, 14. Un segmento di aorta toracica da un maschio donatore è stato interposto chirurgicamente in una aorta addominale di un destinatario femminile, e aorte state raccolte a 4 settimane dopo il trapianto (Figura 1A). L'analisi istologica di innesti dell'arteria è stato eseguito da Elastica-van Gieson (EVG), H & E e di immunoistochimica con VSMC SMA marcatore e marcatore pan-leucociti CD45. Nessun rigetto del trapianto è stata osservata tra C57BL/6J topi maschi nel trapianto di aorta. Maschio a femmina transplantatione indotta GA, caratterizzata da infiltrazione di leucociti e formazione di neointima con accumulo di VSMC (Figura 1B). Per determinare il ruolo di IFN-γ segnalazione in GA, aorte da WT o IFN-γR-KO topi sono stati trapiantati a WT destinatario femminile. Delezione di IFN-γR negli innesti donatore esibito una minore infiltrazione di leucociti e formazione di neointima con diminuzioni di cellule SMA-positive rispetto al WT (non mostrato). Questi risultati supportano un ruolo critico per IFN-γ segnalazione in progressione GA come precedentemente osservato nel topo umanizzato xenotrapianto trapianto modello 4, 15, 17, 18.
Arteriosclerosi innesto IFN-γ-indotta: E 'stato stabilito che l'IFN-γalone è sufficiente per indurre la formazione di neointima in un topo umanizzato modello GA 15, 17. Qui abbiamo creato un mouse singenico modello arteriosclerosi innesto IFN-γ-mediata. In questo modello, WT aorte maschili sono stati trapiantatiin topi riceventi IFN-γR-carenza seguita da un'iniezione endovenosa di replica-carente adenovirus codificante il topo IFN-γ transgene (Ad-IFN-γ) o del gene LacZ controllo (Ad-LacZ) (Figura 2A). Dell'infezione epatica ed espressione del transgene fegato di Ad-LacZ stati verificati mediante colorazione X-gal nel gruppo Ad-LacZ ma non l'AD-IFN-γ gruppi come descritto in precedenza 17. Sistemica espressione di IFN-γ nel siero è stato rilevato a un livello di 120-150 ng / ml il giorno 3 e mantenuto fino a 5 settimane in Ad-IFN-γ ma non nel gruppo LacZ. Aorte sono state raccolte a 5 settimane dopo l'iniezione di adenovirus per l'analisi istologica e la valutazione morfometrica delle arterie trapianto intima, media, lume e zona della nave. L'espressione di IFN-γ, ma non il controllo LacZ, formazione neointimal indotta. Nessuna infiltrazione di leucociti evidente stato rilevato rispetto al modello di allotrapianto (Figura 2B). Questi dati sono coerenti con il precedenteosservazioni umanizzato modello di xenotrapianto di topo che solo IFN-γ è sufficiente per indurre formazione di neointima 15, 17.
Figura 1. Illustrazione e schema di topo allogenico arteria modello di trapianto. A. Un esempio di procedura di trapianto allogenico. Un segmento di donatore maschio aorta toracica stata chirurgicamente interposto in aorta addominale in un ricevente femmina. Aorte sono state raccolte a 4 settimane dopo il trapianto. Come controllo, un segmento del maschio donatore aorta toracica stata chirurgicamente interposto in un aorta addominale in un ricevente maschile. B. L'analisi istologica di innesti dell'arteria by Elastica-van Gieson (EVG), H & E e di immunoistochimica con anticorpi anti-a-SMA e anti-CD45. Microfotografie rappresentativi sono riportati. Punte di freccia indicano la lamina elastica interna per delineare l'intima da un supporto. Scalabarra: 50 mm. No arteriosclerosi innesto è stato osservato in maschio a gruppo maschile.
Figura 2. IFN-γ indotta topo singenici modello di trapianto arteria. A. Uno schema del mouse modello singenico IFN-γ-indotta. Donatore maschio arteria toracica è stato dissezionato e trapiantato in aorta addominale a destinatari maschi IFN-γR topi KO. Una settimana dopo l'intervento chirurgico, 1X10 9 PFU Ad-mIFN-γ o Ad-LacZ è stato iniettato in topi riceventi tramite vena giugulare. Siero è stato raccolto il giorno 3, 7 e 35 post-iniezione di virus per IFN-γ misurazione. Gli innesti sono stati raccolti 6 settimane per la valutazione morfometrica. B. L'analisi istologica di innesti dell'arteria da immunoistochimica con anticorpi anti-a-SMA e anti-CD45. Microfotografie rappresentativi sono riportati. Punte di freccia indicano la lamina elastica interna per delineare l'intima da un supporto. Scala Bar: 50 mm. No arteriosclerosi innesto è stato osservato in gruppo LacZ.
| Passo | Problema | Possibile ragione | Soluzione |
| 2.17 | Sanguinamento grave | Il gap (distanza tra due punti) è troppo grande, in particolare dei punti staccati. | La distanza tra ogni due punti deve essere uniforme durante anastomosi. Aggiungere un punto di sanguinamento sito. |
| Solo l'avventizia è cucita. | Identificare e cuciture tutta la parete aortica | ||
| Rami legname Unligated | Legando i rami legname | ||
| Usare troppo eparina | Utilizzando fino a 40 ml / kg eparinizzata (100 U / ml) di soluzione salina per irrigare il campo chirurgico durante anastomosi. | ||
| 2.19 | Trombosi | Lumen è troppo stretta a sito anastomotica, in particolare di sutura continua. | Evitare anastomosing troppi parete aortica in ogni punto. La dimensione aorta di topo è molto piccola. Cucire troppi parete aortica durante anastomosi causerà lume stretto e trombosi, tuttavia, da ricamare muro troppo meno aortica si tradurrà in una grave emorragia. |
| Il pass sutura attraverso la parete aortica sul lato opposto. | Identificare la parete aortica e quindi fare punti. Se è successo, l'operatore deve tagliare il nodo di sutura e ri-punto in questo sito. | ||
| Le cellule endoteliali sono feriti durante anastomosi. | Utilizzando le suture per anastomosi. Non tenere / spremere tutta la parete arotic da perCEPS per anastomosi. | ||
| L'eparina non viene utilizzato durante anastomosi. | La dimensione aorta di topo è molto piccola. È molto facile per la formazione trombosi negli innesti dopo anastomosi. Dando eparina per irrigare il campo chirurgico è molto importante per ridurre la trombosi. Il tasso di successo del trapianto di nave nei topi è di circa il 50% senza l'utilizzo di eparina e 95-100% con l'utilizzo di eparina. Se la trombosi viene trovato entro pochi minuti dopo il ripristino del flusso sanguigno, un approccio alternativo per rimuovere la trombosi è di iniettare 30-50 ul heparinied soluzione salina (100 U / ml) tramite IVC. Non iniettare troppa eparina solo in caso di gravi emorragie. | ||
| 2.23 | Trapianto fallito | Sanguinamento e trombosi ritardata, o altri | Il trapianto nave in topi è la chirurgia molto difficile per la dimensione aorta di topo è molto piccola. Ci sono poi tre tastinti per l'intervento chirurgico di successo: 1) verificare che le pareti aortiche di host e donatori vengono anastomizzati insieme senza ovviamente gap, solo in caso di gravi emorragie, 2) mantenere lo spazio sufficiente a lume sito anastomotica, solo in caso di trombosi; 3) utilizzare eparina in una giusta dose durante anastomosi, solo in caso di trombosi ed emorragie gravi. A seguito di questo protocollo, il tasso di successo per l'autore è più del 95%. |
Tabella 1. Risoluzione dei problemi da tavolo.
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Discussion
I protocolli descritti si concentrano su modelli murini GA. Le procedure possono essere applicate ad altri modelli di trapianto innesto. Questi modelli includono xenotrapianto umanizzato (cioè segmenti di arterie coronariche umane interposti nella aortae infra-renale di topi immunodeficienti), e il rigetto acuto del mouse modello GA (cioè una aorta mouse da un ceppo genetico in un altro ceppo ricevente genetica). I nostri modelli murini descritti sono più per chiudere le lesioni GA umani. Il primo modello prevede l'interposizione di un segmento del vaso da un topo maschio in una femmina destinatario dello stesso ceppo inbred (C57BL/6J). Rigetto in questo caso è diretto solo contro antigeni di istocompatibilità minori codificate dal cromosoma Y (presente nel maschio, ma non la femmina) e la risposta di rifiuto che ne deriva è sufficientemente indolente di conservare le cellule muscolari lisce derivate dal donatore per diverse settimane 2, 6 , 8-10, 12, 14. Il secondo modello prevede l'interposizione di un segme arteriant da un ceppo selvatico C57BL/6J topo donatore in un topo ospite dello stesso ceppo e genere che manca il recettore per IFN-γ (IFN-γR-KO), seguito da somministrazione di topo IFN-γ (distribuito mediante infezione del mouse fegato con un vettore adenovirale.) Non c'è rigetto in questo caso come donatore e topi riceventi sono dello stesso ceppo e genere ma donatori cellule muscolari lisce proliferano in risposta alla citochina mentre ospitanti cellule derivate, privo recettore per questa citochina, sono insensibili 21. Inoltre, da backcrossing ulteriori cambiamenti genetici nella nave cedente, entrambi i modelli possono essere utilizzati per valutare l'effetto di geni specifici sulla proliferazione delle cellule muscolari lisce IFN-γ-driven e la progressione GA.
Il ruolo di IFN-γ in modelli murini GA non è stato ben definito. I nostri due modelli murini hanno verificato il ruolo di IFN-γ nel topo GA. Nel primo modello, una aorta donatore maschile viene trapiantato nel ricevente femminilemodo che l'host induce risposte allo-mediate da cellule T alloreattive contro il maschio-specifico minore di istocompatibilità HY espresso sui innesti 12. Infatti, WT (C57BL/6J) maschio a femmina C57BL/6J trapianto indotta GA, caratterizzata da infiltrazione di leucociti e la formazione di neointima con accumulo VSMC. Al contrario, i maschi al trapianto di aorta maschio non induce GA. Abbiamo determinato il ruolo di IFN-γ segnalazione nelle cellule vascolari utilizzando IFN-γR-KO come innesto donatore trapiantato a WT destinatario femminile. Soppressione di IFN-γR negli innesti donatori smussati infiltrazione leucocitaria e l'accumulo VSMC nella neointima. Pertanto, il ruolo di IFN-γ nel modello attuale mouse è coerente con il modello di topo umanizzato trapianto xenotrapianto dove IFN-γ segnalazione nelle innesto è critica per la progressione GA 4, 15, 17, 18. Abbiamo determinato se IFN-γ da sola è sufficiente ad indurre la formazione della neointima creando un IFN-γ-mediated topo singenico modello arteriosclerosi innesto. In questo modello, un maschio aorta viene trapiantato in un maschio IFN-γR-KO destinatario animali a cui topo IFN-γ viene poi sistemicamente espressa mediante iniezione endovenosa di adenovirus deficiente replica-codificante il topo IFN-γ transgene (Ad-IFN-γ ). Abbiamo osservato che l'espressione di IFN-γ, ma non il controllo LacZ, formazione neointimal indotto. In questo modello, nessuna infiltrazione di leucociti evidente viene rilevato rispetto al modello eterologo, coerente con le precedenti osservazioni in un'arteria-SCID modello di trapianto di topo umano in cui vascolare IFN-γ segnalazione solo è sufficiente per indurre la formazione della neointima in assenza di leucociti 15, 17.
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Disclosures
Non abbiamo nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni NIH R01 HL109420 a WM e AHA 9320033N a LY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J (H-2b) | Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) | 000664 | Donor (5 weeks) Recipient (8-12weeks) |
| Ketamine Hydrochloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | Storage Solution(50 mg/ml) Working Solution(5 mg/ml) |
| Xylazine Sterile Solution | Lloyd Inc. | NADA# 139-236 | Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution(1 mg/ml) |
| Ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-4396-01 | Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution-oral (0.027 mg/ml) |
| Heparin Sodium | Sagent Pharmaceticals | NDC 25021-400 | Storage Solution(1000 U/ml) Working Solution(100 U/ml) |
| Saline solution (Sterile 0.9% Sodium Chloride) | CareFusion | AL4109 | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | To prepare the anesthetic |
| Petrolatum Ophthalmic Ointment | Dechra Veterinary Products | NDC 17033-211-38 | |
| Iodine Prep Pads | Triad Disposables, Inc. | NDC 50730-3201-1 | |
| Alcohol Prep Pads | McKesson Corp. | NDC 68599-5805-1 | |
| Microscope | Leica | MZ95 | |
| Micro Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5693 | |
| Spring Scissors | F.S.T | 15009-08 | To transect the aorta of donor or recipient |
| Extra Narrow Scissors | F.S.T | 14088-10 | |
| Needle Holder/Forceps | MICRINS | MI1542 | To hold the needle |
| Fine Forceps | F.S.T | 11254-20 | |
| Forceps | F.S.T | 11251-35 | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Forceps | F.S.T | 13011-12 | |
| LANCASTER Eye Speculum | Zepf Medical Instruments | 42-1209-07 | |
| Micro Vascular Clip | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6472 | |
| Micro Clip Applying Forceps With Lock | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5440 | |
| Black Polyamide Monofilament Suture | AROSurgical Instruments Corporation | Cat #T4A10Q07 | 10-0 suture, Needle=70 microns |
| Black Monofilament Nylon Suture | Syneture (Covidien) |
SN-1956 | 6-0 suture |
| Non-Woven Songes | McKesson Corp. | Reorder No. 94442000 | |
| 1 ml Syringe | BD | REF 309659 | |
| 3 ml Syringe | BD | REF 309657 | |
| 10 ml Syringe | BD | REF 309604 | |
| 18G 1 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305196 | |
| 25G 7/8, Hypodermic Needle | BD | REF 305124 | |
| 27G 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305109 | |
| 30G 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305106 | |
| Hearting Pad | Sunbeam | Z-1228-001 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Table 2. Specific reagents and equipment. | |||
References
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