Summary

Исследование поляризации Использование макрофагов костного мозга макрофагов

Published: June 23, 2013
doi:

Summary

В статье описана легко легко адаптивная<em> В пробирке</em> Модель для изучения поляризации макрофагов. В присутствии GM-CSF/M-CSF, гемопоэтические стволовые клетки / клетки-предшественники из костного мозга направлены на дифференциацию моноцитов, а затем М1 или М2 стимуляции. Состояние активации можно отслеживать изменения в антигены на поверхности клеток, экспрессию генов и путей клеточной сигнализации.

Abstract

В статье описана легко легко адаптивная в пробирке модель для исследования макрофагов поляризации. В присутствии GM-CSF/M-CSF, гемопоэтические стволовые клетки / клетки-предшественники из костного мозга направлены на дифференциацию моноцитов, а затем М1 или М2 стимуляции. Состояние активации можно отслеживать изменения в антигены на поверхности клеток, экспрессию генов и путей клеточной сигнализации.

Introduction

Отличной от классической воспалительной реакции, макрофаги, которые пропитывают ткани часто демонстрируют поляризованного состояния активации, который играет важную роль в регуляции тканей хозяина физиологические функции 1-8. При стимуляции, активации макрофагов можно разделить на классические (M1) и альтернативные (М2) активация 2, 4, 9. M1 активации макрофагов зависит от Toll-подобных рецепторов (TLR,) и активацию ядерного фактора каппа В (NFκB) / с-Jun N-концевой киназы 1 (JNK1), что приводит к продукции воспалительных цитокинов, таких как TNF-α и IL- 1β и активации иСОА, что приводит к увеличению образования активных форм кислорода, таких как нитрид азота (NO) 10, 11. В противоположность этому, M2 активации макрофагов новобранцев PPAR-, PPAR, или IL-4 STAT6 путей, что приводит к альтернативе, противовоспалительные (М2) активации, которая связана с активацией рецептора маннозы CD206 и аргиназа 1 (Arg1) 6, 12 – 14 </ Вир>.

Костного мозга макрофагов (BMDM) представляют идеал в пробирке модель, чтобы понять механизмы, контролирующие поляризации активированными макрофагами 15. В частности, активация М1 макрофагов может быть индуцирована липополисахаридов (ЛПС) стимуляции, тогда поляризации M2 макрофагов может быть индуцирована IL-4 и / или IL-13. Зрелые костного мозга макрофаги и активированные макрофаги могут быть идентифицированы посредством анализа потока цитометрии экспрессии поверхностных антигенов, в том числе CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 и CD86, 9, 16, 17. Кроме того, изменения в продукции цитокинов и клеточных сигнальных путей, связанных с макрофагами поляризации можно измерить с помощью ОТ-ПЦР и вестерн-блоттинга, соответственно. Таким образом, мыши костного мозга макрофаги могут служить соответствующие модели для изучения макрофаг поляризации в пробирке.

Protocol

1. Выделение клеток костного мозга Изолировать бедра и голени кости от 6-8 недельных мышей, ополоснуть волосы, а затем разрезать кости. Используйте 21G иглу и шприц объемом 10 мл, чтобы избавиться от мозга в холодной PBS +2% тепла инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (FB…

Representative Results

Схематическое описание BMDM процедура генерации представлен (Рис. 1). Высокая чистота зрелых макрофагов можно наблюдать на 7-й день, когда они представляют от 95 до 99% + F4/80 CD11b + клеток (рис. 2). Поляризованные макрофаги могут анализироваться с помощью антител против CD11b, F4/80, CD…

Discussion

Мы сообщаем здесь простые и легко адаптируются в пробирке процедуры, чтобы вызвать активацию макрофагов, полученных из клеток костного мозга предшественников. Эта процедура может быть использована для исследования механизмов, ответственных за поляризации макрофагов. Чистота зр…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа выполнена при поддержке Американской Ассоциации Сердца (BGIA 7850037 доктору Beiyan Чжоу).

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
IMDM Thermo Scientific SH30259.01
Fetal bovine serum Invitrogen 10438-026
Murine GM-CSF PeproTech 315-03
NH4Cl StemCell Technologies 7850
L-929 ATCC CCL-1
70 μm cell strainer BD Biosciences 352350
10 x PBS Thermo Scientific AP-9009-10
Anti-mouse CD11b-APC eBioscience 17-0112-81
Anti-mouse F4/80-FITC eBioscience 11-4801-81
Anti-mouse CD69-PE eBioscience 12-0691-81
Anti-mouse CD86-PE eBioscience 12-0862-81
Propidium Iodine Invitrogen P3566

References

  1. Meng, Z. X., Wang, G. X., Lin, J. D. A microrna circuitry links macrophage polarization to metabolic homeostasis. Circulation. , (2012).
  2. Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. Obesity induces a phenotypic switch in adipose tissue macrophage polarization. J. Clin. Invest. 117, 175-184 (2007).
  3. Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).
  4. Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
  5. Tabas, I. Macrophage death and defective inflammation resolution in atherosclerosis. Nat. Rev. Immunol. 10, 36-46 (2010).
  6. Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Goforth, M. H., Morel, C. R., Subramanian, V., Mukundan, L., Eagle, A. R., Vats, D., Brombacher, F., Ferrante, A. W., Chawla, A. Macrophage-specific pparg controls alternative activation and improves insulin resistance. Nature. 447, 1116-1120 (2007).
  7. Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Red Eagle, A., Vats, D., Morel, C. R., Goforth, M. H., Subramanian, V., Mukundan, L., Ferrante, A. W., Chawla, A. Alternative m2 activation of kupffer cells by ppard ameliorates obesity-induced insulin resistance. Cell Metabolism. 7, 496-507 (2008).
  8. Vats, D., Mukundan, L., Odegaard, J. I., Zhang, L., Smith, K. L., Morel, C. R., Greaves, D. R., Murray, P. J., Chawla, A. Oxidative metabolism and pgc-1[beta] attenuate macrophage-mediated inflammation. Cell Metabolism. 4, 13-24 (2006).
  9. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8, 958-969 (2008).
  10. Arkan, M. C., Hevener, A. L., Greten, F. R., Maeda, S., Li, Z. -. W., Long, J. M., Wynshaw-Boris, A., Poli, G., Olefsky, J., Karin, M. Ikk-b links inflammation to obesity-induced insulin resistance. Nat. Med. 11, 191-198 (2005).
  11. Saberi, M., Woods, N. -. B., de Luca, C., Schenk, S., Lu, J. C., Bandyopadhyay, G., Verma, I. M., Olefsky, J. M. Hematopoietic cell-specific deletion of toll-like receptor 4 ameliorates hepatic and adipose tissue insulin resistance in high-fat-fed mice. Cell Metab. 10, 419-429 (2009).
  12. Kang, K., Reilly, S. M., Karabacak, V., Gangl, M. R., Fitzgerald, K., Hatano, B., Lee, C. -. H. Adipocyte-derived th2 cytokines and myeloid ppard regulate macrophage polarization and insulin sensitivity. Cell Metabolism. 7, 485-495 (2008).
  13. Bouhlel, M. A., Derudas, B., Rigamonti, E., Dievart, R., Brozek, J., Haulon, S., Zawadzki, C., Jude, B., Torpier, G., Marx, N., Staels, B., Chinetti-Gbaguidi, G. Pparg activation primes human monocytes into alternative m2 macrophages with anti-inflammatory properties. Cell Metabolism. 6, 137-143 (2007).
  14. Bronte, V., Zanovello, P. Regulation of immune responses by l-arginine metabolism. Nat. Rev. Immunol. 5, 641-654 (2005).
  15. Zhuang, G., Meng, C., Guo, X., Cheruku, P. S., Shi, L., Xu, H., Li, H., Wang, G., Evans, A. R., Safe, S., Wu, C., Zhou, B. A novel regulator of macrophage activation: Mir-223 in obesity-associated adipose tissue inflammation. Circulation. 125, 2892-2903 (2012).
  16. Kradin, R. L., McCarthy, K. M., Preffer, F. I., Schneeberger, E. E. Flow-cytometric and ultrastructural analysis of alveolar macrophage maturation. J. Leukoc. Biol. 40, 407-417 (1986).
  17. Stein, M., Keshav, S., Harris, N., Gordon, S. Interleukin 4 potently enhances murine macrophage mannose receptor activity: A marker of alternative immunologic macrophage activation. J. Exp. Med. 176, 287-292 (1992).
  18. Strassmann, G., Bertolini, D. R., Kerby, S. B., Fong, M. Regulation of murine mononuclear phagocyte inflammatory products by macrophage colony-stimulating factor. Lack of il-1 and prostaglandin e2 production and generation of a specific il-1 inhibitor. J. Immunol. 147, 1279-1285 (1991).
  19. Biswas, S. K., Mantovani, A. Macrophage plasticity and interaction with lymphocyte subsets: Cancer as a paradigm. Nat. Immunol. 11, 889-896 (2010).
  20. Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: In vivo veritas. J. Clin. Invest. 122, 787-795 (2012).

Play Video

Cite This Article
Ying, W., Cheruku, P. S., Bazer, F. W., Safe, S. H., Zhou, B. Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (76), e50323, doi:10.3791/50323 (2013).

View Video