Mesure intracellulaire de Ca^{2 +} Les changements dans le sperme humain à l'aide de quatre techniques: FLUOROMETRIE conventionnel, s'est arrêté Fluorimétrie du flux, la cytométrie en flux et l'imagerie cellulaire unique

Summary

Intracellulaire de Ca^{2 +} Dynamique est très importante dans le sperme physiologie et Ca^{2 +} Sensibles à des colorants fluorescents constituent un outil polyvalent pour les étudier. expériences de la population (fluorimétrie et arrêté fluorometrie de flux) et des expériences de cellules individuelles (cytométrie en flux et l'imagerie cellulaire unique) sont utilisés pour suivre spatio-temporelle [Ca^{2 +}] Changements dans les cellules du sperme humain.

Abstract

Les spermatozoïdes sont des cellules reproductrices mâles spécialement conçues pour atteindre, à reconnaître et fusionner avec l'ovule. Pour effectuer ces tâches, les spermatozoïdes doivent être prêts à faire face à un environnement en constante évolution et de surmonter plusieurs obstacles physiques. Être en essence transcription et translation silencieuse, ces cellules mobiles comptent profondément sur divers mécanismes de signalisation de s'orienter et se baigner dans un mode scène et à composer avec des conditions environnementales difficiles au cours de leur voyage pour trouver l'œuf. En particulier, le Ca ^{2 +} signalisation médiée est essentiel pour plusieurs fonctions de sperme: activation de la motilité, la capacitation (un processus complexe qui prépare le sperme pour la réaction de l'acrosome) et la réaction de l'acrosome (un événement exocytotique qui permet la fusion de sperme oeuf). L'utilisation de colorants fluorescents pour suivre les fluctuations intracellulaires de cet ion est d'une importance remarquable en raison de leur facilité d'application, la sensibilité et la polyvalence de detection. L'utilisation d'un protocole colorant charge unique, nous utilisons quatre techniques différentes fluorimétriques pour surveiller sperme Ca ^{2 +} dynamique. Chaque technique fournit des informations distincte qui permet une résolution spatiale et / ou temporelle, la génération de données, tant au niveau des populations cellulaires cellule unique et.

Introduction

Ca ^{2 +} est un second messager universel de voies de transduction de signaux dans les cellules eucaryotes. ^{Ca2 +} intracellulaire (Ca ^{2 +} _i) participe à la régulation de nombreux processus physiologiques fondamentaux dans les cellules excitables à la fois et non excitable. L'importance et l'universalité de Ca ^{2 +} comme second messager pendant les événements de transduction du signal est dérivé de sa polyvalence spatio-temporelle dans la transmission des informations au sein de la cellule. Alors que Ca ^{2 +} ne peut pas être synthétisé de novo ou dégradés au sein de la cellule, sa concentration intracellulaire ([Ca ^{2 +]} _i) est maintenue dans des limites très strictes à travers différents mécanismes cellulaires tampon en continu, séquestrer, compartimenter et / ou accumuler Ca ^{2 +.} Les variations de la concentration de cet ion peuvent se produire dans des zones très localisées à l'intérieur de la cellule ^1, et à déchiffrer ces fluctuations est essentielle pour avoir une decompréhension de l'EPER (1) de leur rôle dans le mécanisme de signalisation, (2) leur signification physiologique, et (3) les mécanismes généraux de la signalisation cellulaire. Ca ^{2 +} signalisation médiée revêt une importance particulière dans la physiologie de sperme ^2. La motilité des spermatozoïdes est l'une des fonctions les plus importantes pour la réussite de la fécondation, et, en fait, plusieurs anomalies de la motilité des spermatozoïdes peut causer la stérilité ^3-5. L'importance de Ca ^{2 +} dans le mouvement du flagelle est reconnu depuis longtemps ^6, mais le mécanisme de la façon Ca ^{2 +} contrôle la forme spécifique de flagelles flexion n'est pas entièrement comprise.

Avant de fusionner avec l'ovule, les spermatozoïdes doivent subir la capacitation, un processus complexe dépendant de résidence de spermatozoïdes dans le tractus génital féminin. Au cours de capacitation, lipides l'architecture et l'organisation du sperme membrane sont modifiés, principalement en raison de l'élimination du cholestérol de la membrane plasmique. En outre, plusieurs protéines sont tyrosine-phosphoreylated ^7. Fait important, au cours de capacitation il ya une augmentation du pH intracellulaire (pH _i) et de [Ca ^{2 +]} _i, et le potentiel de membrane hyperpolarise chez certaines espèces ^2. Capacitation n'a lieu que dans une sous-population de spermatozoïdes (20-40%), et les mécanismes impliqués dans toutes ces modifications cellulaires sont loin d'être claires. Il est généralement admis que seule une sous-population de spermatozoïdes capacités subir la réaction de l'acrosome (AR) lorsqu'ils sont exposés à des inducteurs physiologiques. L'AR est aussi un événement ^{+ 2} réglementé Ca nécessaire pour la fécondation chez toutes les espèces possédant un acrosome (organite spécialisé avec membranes externes et internes). Au cours de ce processus, les fusibles de la membrane acrosomique externe avec la membrane plasmique du spermatozoïde, libérant des enzymes hydrolytiques qui permettent au spermatozoïde de pénétrer dans la matrice glyco-protéique qui entoure l'ovule (zone pellucide, ou ZP). Le RA expose également une nouvelle surface de la cellule de sperme fusogène qui interagit avecde la membrane plasmique des oeufs pour la fusion finale des deux gamètes. Il ya plusieurs ligands cellulaires qui induisent l'AR, la progestérone est l'un des plus étudiés parmi eux.

Dans ce travail, nous présentons quatre différentes techniques impliquant l'utilisation d'un ² colorant fluorescent ⁺ sensible Ca à mesurer [Ca ^{2 +]} _i changements dans le sperme humain provoqué par la progestérone (à l'exception de la cytométrie de flux, dans laquelle nous avons mesuré la [Ca ^{2 +} ] _i augmentation induite pendant le processus de capacitation in vitro). Dans ce cas particulier, nous avons utilisé Fluo-3 AM (Life Technologies, Grand Island, NY), un colorant membrane perméable avec un _Kd = 325 nM. In vitro, nous avons suivi les changements de fluorescence en fonction du temps avec trois des méthodologies, et avec la quatrième technique, nous avons mesuré des valeurs de fluorescence en un seul point donné dans le temps. Ces différentes approches se complètent les uns les autres, car ensemble, ils fournissent res spatiales et temporellesolution, tant au niveau de la population cellulaire de la cellule unique et.

Population cellulaire ou expériences en vrac

Techniques en vrac sont largement utilisés non seulement parce que les instruments dont ils ont besoin sont disponibles, mais aussi parce qu'ils sont simples, bien établi, et permettent l'étalement de l'information à partir de mesures effectuées sur des millions de cellules en une seule expérience.

Technique n ° 1. Fluorimétrie conventionnel
Cette technique surveille les variations de la fluorescence en fonction du temps, et les expériences sont réalisées dans des cuves en verre avec des volumes d'échantillon allant de 200 à 1000 pl. Un bon mélange de réactifs ont été ajoutés nécessite une agitation magnétique, et donc la résolution temporelle obtenue est de l'ordre de quelques secondes. La gamme de concentration cellulaire typique des échantillons analysés est de 10 ⁵ -10 ⁸ cellules / ml.

Technique n ° 2. Fluorimétrie Flow arrêté
Tsa technique surveille également les variations de la fluorescence en fonction du temps, mais les réactifs sont rapidement mélangés ensemble (en utilisant la pression) dans une cuvette d'enregistrement contenant un très faible volume de l'échantillon (allant de 25 à 100 pl). Par conséquent, l'homogénéisation des réactifs est instantané, ce qui permet une haute résolution temporelle de l'ordre de millisecondes. L'analyse des traces de fluorescence en fonction du temps qui en résultent sont aptes à déterminer les taux de réaction, l'élucidation de la complexité du mécanisme de réaction, d'obtenir des informations sur les intermédiaires de réaction de courte durée, etc La gamme de concentration cellulaire commun des échantillons analysés est de 10 ⁵ -10 ⁷ cellules / ml.

Simples expériences sur des cellules

Expériences en vrac signalent le comportement moyen d'un grand nombre de cellules, mais une population peut souvent présenter des propriétés hétérogènes qui sont négligés au cours de ce type de mesures. Techniques unicellulaires sont donc utilisés pour compléter èmeinformation e obtenu avec les expériences des populations cellulaires.

Technique n ° 3. cytométrie en flux
Malgré l'importance de l'information découlant de mesures de cellules simples, il est important d'analyser un grand nombre de cellules afin d'éviter l'extrapolation erronée des propriétés spécifiques des cellules d'une population entière. Pour cette raison, des techniques à haut débit sont favorisés et la méthode la plus populaire est la cytométrie de flux, dont 10.000 cellules par état sont classiquement analysées. Cette méthode permet une analyse multi-paramétrique de populations hétérogènes, car elle classe les cellules en fonction de leur taille (diffusion vers l'avant (FSC)), la granularité (diffusion latérale (SSC)) et de l'intensité de fluorescence (marquage spécifique avec un anticorps, un marqueur de viabilité, etc) , fournissant ainsi des informations sur la répartition des paramètres d'un groupe de cellules. La cytométrie en flux permet instant plutôt que de l'information dépendant du temps ^8. Avant et sur le côté des valeurs disperser are aussi utile pour sélectionner une porte qui comporte des cellules, mais discrimine les débris cellulaires, la poussière, etc Pour des mesures de fluorescence, les contrôles de fluorescence négatifs et positifs doit également être inclus. Si plus d'un canal de fluorescence est utilisé, un processus connu sous le nom compensation doit être effectué (voir détails http://www.bdbiosciences.com/resources/protocols/setting_compensation.jsp ). Compensation permet de chevauchement spectral discrimination entre les fluorophores. La cytométrie en flux permet en outre la discrimination de cellules mortes, généralement au moyen d'iodure de propidium coloration.

Technique n ° 4. Imagerie cellulaire unique
La microscopie est une autre méthode commune pour étudier le comportement de cellules individuelles, il est bien adapté pour les études en fonction du temps et il fournit également la résolution spatiale. Un inconvénient majeur est que l'analyse à haut débit est seulement à ses débuts à l'heure actuelle <sup> 9.

Protocol

Dans cet article, nous présentons l'utilisation des quatre techniques mentionnées ci-dessus pour mesurer [Ca 2 +] i changements dans les cellules du sperme humain. Nous avons utilisé la progestérone pour déclencher une réponse Ca 2 +, car il est bien établi que ce stéroïde produit transitoire [Ca 2 +] i augmenter dans les spermatozoïdes. En particulier, dans le sperme humain, de la progestérone active directement un canal de Ca 2 + (à savo…

Representative Results

Figure 1. Schéma du protocole expérimental pour le sperme préparation d'échantillons par la méthode swim-up. Les principales étapes de la séparation de spermatozoïdes mobiles et pour l'ajustement de leur concentration sont illustrés. La dernière étape d'incubation est effectuée uniquement lorsque…

Discussion

Signalisation intracellulaire est vital pour la plupart des activités cellulaires; Ca ^{2 +} est un messager ubiquitaire qui accompagne les cellules de mammifères pendant toute leur durée de vie, de leur origine à la fécondation, à la fin de leur cycle de vie. En réponse à différents stimuli, [Ca ^{2 +]} i augmente, oscille et diminue avec la codification spatio-temporelle, en conséquence, divers procédés sont activés, modulés ou résilié par le Ca ^{2 +} messages codés. ^{Ca2 …}

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Ham’s F-10	Sigma-Aldrich	N-6013
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A-7906
Calcium Chloride Dihydrate approx. 99%	Sigma-Aldrich	C-3881
Makler Counting Chamber	SEFI Medical Insruments LTD	SEF-MAKL
Fluo-3 AM	Invitrogen	F-1242	20 vials/50 μg each
Ionomycin	Alomone	I-700
Progesterone	Sigma-Aldrich	P0130
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S-9888	Reagents for human sperm medium (HSM)
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P-3911	Reagents for human sperm medium (HSM)
Sodium bicarbonate	JT Baker	3506	Reagents for human sperm medium (HSM)
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M-2670	Reagents for human sperm medium (HSM)
Calcium chloride anhydrous	Sigma-Aldrich	C-1016	Reagents for human sperm medium (HSM)
HEPES	Sigma-Aldrich	H-3125	Reagents for human sperm medium (HSM)
D-Glucose	JT Baker	1906-01	Reagents for human sperm medium (HSM)
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P-2256	Reagents for human sperm medium (HSM)
Sodium L-lactate (aprox. 99%)	Sigma-Aldrich	L- 7022	Reagents for human sperm medium (HSM)
Propidium Iodide	Invitrogen	L-7011	Component B
Triton X-100 (t-Octylphenoxypolyethoxyethanol)	Sigma- Aldrich	X-100	2.4 mM solution in water
Round coverslip	VWR	48380 080	25 mm diameter
Poly-L-lysine solution	Sigma-Aldrich	P8920
Manganese chloride	Sigma-Aldrich	M-3634
Attofluor; Cell Chamber, for microscopy	Life technologies	A-7816
Dimethyl Sulphoxide	Sigma-Aldrich	D2650	5×5 ml