Misurare intracellulare Ca^{2 +} Modifiche di sperma umano utilizzando quattro tecniche: fluorometria convenzionale, si fermò fluorometria Flow, Citometria a flusso singolo e l'imaging cellulare

Summary

Intracellulare di Ca^{2 +} Dinamiche sono molto importanti in sperma fisiologia e Ca^{2 +} Sensibili coloranti fluorescenti costituiscono uno strumento versatile per studiarli. Esperimenti di popolazione (fluorometria e fermato il flusso fluorometria) ed esperimenti cella singola (citometria a flusso e l'imaging di singola cellula) sono utilizzati per tenere traccia spazio-temporale [Ca^{2 +}] Cambiamenti nelle cellule di sperma umano.

Abstract

Gli spermatozoi sono cellule riproduttive maschili specialmente progettati per raggiungere, riconoscere e fondersi con l'uovo. Per eseguire queste attività, gli spermatozoi devono essere preparati ad affrontare un ambiente in costante evoluzione e per superare le numerose barriere fisiche. Essere in sostanza transcriptionally e translationally silenziosa, queste cellule mobili affidano profondamente su diversi meccanismi di segnalazione di orientarsi e di nuotare in modo diretto, e fare i conti con le difficili condizioni ambientali durante il loro viaggio per trovare l'uovo. In particolare, Ca ^{2 +-mediata} segnalazione è fondamentale per diverse funzioni spermatiche: attivazione della motilità, capacitazione (un processo complesso che prepara lo sperma per la reazione acrosomiale) e la reazione acrosomiale (un evento esocitotico che permette la fusione spermatozoo-uovo). L'uso di coloranti fluorescenti per monitorare fluttuazioni intracellulari di questo ione è di notevole importanza per la loro facilità di applicazione, sensibilità e versatilità di detezione. Utilizzando un unico protocollo di colorante di caricamento utilizziamo quattro diverse tecniche di fluorimetrici per monitorare lo sperma Ca ^{2 +} dinamica. Ciascuna tecnica fornisce informazioni distinta che consente la risoluzione spaziale e / o temporale, generando dati sia a singola cella e di popolazioni cellulari.

Introduction

Ca ^{2 +} è un secondo messaggero universale di vie di trasduzione del segnale in cellule eucariotiche. Intracellulare di Ca ^{2 +} (Ca ^{2 +} _i) partecipa alla regolazione di molti processi fisiologici fondamentali nelle cellule sia eccitabili e non eccitabili. L'importanza e l'universalità di Ca ^{2 +} come secondo messaggero durante eventi di trasduzione del segnale è derivato dalla sua versatilità spazio-temporale nella trasmissione delle informazioni all'interno della cellula. Mentre Ca ^{2 +} non possono essere sintetizzati de novo o degradati all'interno della cellula, la sua concentrazione intracellulare ([Ca ^{2 +]} _i) viene mantenuta entro limiti molto ristretti attraverso diversi meccanismi cellulari che continuamente tampone, sequester, compartimenti stagni, e / o accumulare Ca ^{2 +.} Cambiamenti nella concentrazione di questo ione possono verificarsi in aree molto localizzate all'interno della cella ^1, e decifrare tali fluttuazioni è essenziale per ottenere una deeper comprensione di (1) il loro ruolo nel meccanismo di segnalazione, (2) il loro significato fisiologico, e (3) meccanismi generali di segnalazione cellulare. Ca ^{2 +-mediata} segnalazione è di particolare importanza in sperma fisiologia ^2. La motilità degli spermatozoi è una delle funzioni più importanti per il successo la fecondazione, e in effetti, diversi difetti della motilità degli spermatozoi può causare sterilità ^3-5. L'importanza di Ca ^{2 +} in movimento flagellare tempo è stato riconosciuto ^6, tuttavia, il meccanismo di come Ca ^{2 +} controlla la forma specifica di flagellare curvatura non è completamente nota.

Prima di fondersi con l'uovo, spermatozoi deve subire capacitazione, un processo complesso alla residenza spermatozoo all'interno del tratto femminile. Durante la capacitazione, architettura lipidico della membrana e l'organizzazione spermatozoi vengono modificati, soprattutto a seguito della rimozione del colesterolo dalla membrana plasmatica. Inoltre, diverse proteine ​​sono tirosin-fosforoylated ^7. Soprattutto, durante la capacitazione vi è un aumento del pH intracellulare (pH _i) e in [Ca ^{2 +]} _i, e il potenziale di membrana hyperpolarizes in alcune specie ^2. Capacitazione avviene solo in una sottopopolazione di spermatozoi (20-40%), ed i meccanismi coinvolti in tutti questi cambiamenti cellulari sono tutt'altro che chiare. E 'generalmente accettato che solo una sottopopolazione di spermatozoi capacitati subiscono la reazione acrosomiale (AR), quando esposti ad induttori fisiologici. L'AR è anche un evento di ^{2 +-regolamentato} Ca richiesto per la fertilizzazione in tutte le specie che possiedono un acrosomiale (organello specializzato con le membrane esterne ed interne). Durante questo processo i fusibili membrana acrosomiale esterna con la membrana plasmatica dello spermatozoo, rilasciando enzimi idrolitici che permettono al spermatozoo di penetrare la matrice glico-proteico che circonda l'uovo (zona pellucida, o ZP). L'AR espone anche una nuova superficie spermatozoo fusogenica che interagisce conla membrana plasmatica uovo per la fusione finale di entrambi i gameti. Ci sono diversi ligandi cellulari che inducono l'AR, progesterone essendo uno dei più studiati tra loro.

In questo lavoro presentiamo quattro diverse tecniche che prevedono l'utilizzo di un colorante fluorescente Ca ^{2 +-sensibile} da misurare [Ca ^{2 +]} _i cambiamenti di sperma umano innescata dal progesterone (tranne per citometria di flusso, in cui abbiamo misurato la [Ca ^{2 +} ] _i aumentare indotta durante il processo di capacitazione in vitro). In questo caso particolare abbiamo utilizzato Fluo-3 AM (Life Technologies, Grand Island, NY), un colorante membrana permeabile con una K _d = 325 nM. In vitro abbiamo monitorato cambiamenti di fluorescenza in funzione del tempo con tre delle metodologie, e con la quarta tecnica abbiamo misurato valori di fluorescenza in un singolo punto nel tempo dato. Questi diversi approcci sono complementari, in quanto del tutto che forniscono risoluzione spaziale e temporaleoluzione sia a singola cella e livelli di popolazione di cellule.

Cella Popolazione o esperimenti Bulk

Tecniche di bulk sono ampiamente utilizzati non solo perché gli strumenti di cui hanno bisogno sono facilmente disponibili, ma anche perché sono semplici, ben consolidata, e consentono il calcolo della media delle informazioni a misurazioni effettuate su milioni di cellule in un singolo esperimento.

Tecnica # 1. Fluorometria convenzionale
Questa tecnica monitora le variazioni nella fluorescenza in funzione del tempo; gli esperimenti sono eseguite in provette di vetro con volumi di campione da 200 a 1.000 microlitri. Corretta miscelazione dei reagenti aggiunti richiede agitazione magnetica, e quindi la risoluzione temporale ottenuta è dell'ordine di secondi. L'intervallo di concentrazione cellulare tipica dei campioni analizzati è di 10 -10 ^{8 5} cellule / ml.

Tecnica # 2. Arrestato fluorometria flusso
Tsua tecnica controlla anche cambiamenti nella fluorescenza in funzione del tempo, ma i reagenti vengono rapidamente miscelati tra loro (mediante pressione) in una cuvetta di registrazione contenente un volume di campione molto piccolo (che vanno 25-100 microlitri). Pertanto, omogeneizzazione dei reagenti è istantanea, consentendo un'elevata risoluzione temporale nell'ordine di millisecondi. Analisi delle tracce risultanti fluorescenza in funzione del tempo sono adatte per determinare le velocità di reazione, chiarire la complessità del meccanismo di reazione, ottenendo informazioni sulle intermedi di reazione breve durata, ecc L'intervallo di concentrazione cellulare comune dei campioni analizzati è 10 ⁵ -10 ⁷ cellule / ml.

Esperimenti Single Cell

Esperimenti bulk riportano il comportamento medio di un gran numero di cellule, tuttavia, una popolazione può frequentemente esibire proprietà eterogenee che sono trascurati durante tale tipo di misure. Tecniche di singola cella sono quindi utilizzati per integrare thinformazioni e ottenuto con esperimenti popolazioni cellulari.

Tecnica # 3. Citometria a Flusso
Nonostante l'importanza delle informazioni derivanti da misurazioni singola cellula, è importante analizzare un gran numero di celle per impedire l'estrapolazione erronea proprietà cellula-specifici per un'intera popolazione. Per questo motivo, le tecniche ad alta produttività sono favorite e il metodo più popolare è citometria di flusso, in cui 10.000 cellule per condizione sono convenzionalmente analizzati. Questo metodo consente l'analisi multi-parametrica di popolazioni eterogenee come è categorizza le cellule in base alla loro dimensione (forward scatter (FSC)), granularità (side scatter (SSC)) e di intensità di fluorescenza (etichettatura specifica con un anticorpo, marcatore viabilità, ecc) , fornendo così informazioni sulla distribuzione dei parametri 'per un gruppo di celle. Citometria a flusso fornisce immediata, piuttosto che le informazioni in funzione del tempo ^8. In avanti e laterale valori scatter are anche utile per selezionare una porta che include celle ma discrimina detriti cellulari, polvere, ecc Per misure di fluorescenza, fluorescenza controlli negativi e positivi deve essere inclusa anche. Se viene usato più di un canale di fluorescenza, un processo noto come compensazione deve essere eseguita (per dettagli vedere http://www.bdbiosciences.com/resources/protocols/setting_compensation.jsp ). Compensazione consente sovrapposizione spettrale discriminazione tra fluorofori. Citometria di flusso consente anche la discriminazione di cellule morte, generalmente per mezzo di propidio ioduro colorazione.

Tecnica # 4. Singolo Imaging cellulare
Microscopia è un altro metodo comune per studiare il comportamento di singole cellule, ma è adatto per gli studi di tempo-dipendenti e fornisce anche la risoluzione spaziale. Un grave inconveniente è che l'analisi high-throughput è solo agli inizi in questo momento <sup> 9.

Protocol

In questo articolo riportiamo l'utilizzo delle quattro summenzionate tecniche per misurare la [Ca 2 +] i cambiamenti nelle cellule di sperma umano. Abbiamo usato progesterone per innescare una risposta di Ca 2 +, in quanto è noto che questo steroide produce un transitorio [Ca 2 +] i in spermatozoi. In particolare, in sperma umano, progesterone attiva direttamente un canale Ca 2 + (ossia CatSper) espresso esclusivamente nella membrana plasmatica di ce…

Representative Results

Figura 1. Rappresentazione schematica del protocollo sperimentale per la preparazione dei campioni di sperma con il metodo semi-sommerso. Le fasi principali per la separazione di spermatozoi mobili e per la regolazione della loro concentrazione sono illustrate. L'ultimo passaggio di incubazione viene eseguita solo q…

Discussion

Segnalazione intracellulare è di vitale importanza per la maggior parte delle attività cellulari; Ca ^{2 +} è un messaggero ubiquitario che accompagna le cellule di mammiferi in tutto il loro intero ciclo di vita, dalla loro origine alla fecondazione, alla fine del loro ciclo di vita. In risposta a stimoli diversi, [Ca ^{2 +]} i aumenta, oscilla e diminuisce con codificazione spazio-temporale, di conseguenza, diversi processi sono attivati, modulate o denuncia da parte di Ca ^{2 +} messaggi co…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Ham’s F-10	Sigma-Aldrich	N-6013
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A-7906
Calcium Chloride Dihydrate approx. 99%	Sigma-Aldrich	C-3881
Makler Counting Chamber	SEFI Medical Insruments LTD	SEF-MAKL
Fluo-3 AM	Invitrogen	F-1242	20 vials/50 μg each
Ionomycin	Alomone	I-700
Progesterone	Sigma-Aldrich	P0130
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S-9888	Reagents for human sperm medium (HSM)
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P-3911	Reagents for human sperm medium (HSM)
Sodium bicarbonate	JT Baker	3506	Reagents for human sperm medium (HSM)
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M-2670	Reagents for human sperm medium (HSM)
Calcium chloride anhydrous	Sigma-Aldrich	C-1016	Reagents for human sperm medium (HSM)
HEPES	Sigma-Aldrich	H-3125	Reagents for human sperm medium (HSM)
D-Glucose	JT Baker	1906-01	Reagents for human sperm medium (HSM)
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P-2256	Reagents for human sperm medium (HSM)
Sodium L-lactate (aprox. 99%)	Sigma-Aldrich	L- 7022	Reagents for human sperm medium (HSM)
Propidium Iodide	Invitrogen	L-7011	Component B
Triton X-100 (t-Octylphenoxypolyethoxyethanol)	Sigma- Aldrich	X-100	2.4 mM solution in water
Round coverslip	VWR	48380 080	25 mm diameter
Poly-L-lysine solution	Sigma-Aldrich	P8920
Manganese chloride	Sigma-Aldrich	M-3634
Attofluor; Cell Chamber, for microscopy	Life technologies	A-7816
Dimethyl Sulphoxide	Sigma-Aldrich	D2650	5×5 ml