Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Montering av Nucleosomal Arrays fra Rekombinant kjerne Histoner og nukleosom Positioning DNA

Published: September 10, 2013 doi: 10.3791/50354
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Biochemistry and Molecular Biology, Colorado State University

Summary

En metode er presentert for tilberedning av modell nucleosomal arrays fra rekombinante kjerne histoner og tandem gjentas nukleosom posisjonering DNA. Vi beskriver også hvordan sedimente velocity eksperimenter i den analytiske ultrasentrifuge, og atomic force mikroskopi (AFM) er brukt til å overvåke omfanget av nucleosomal rekke metning etter tilberedning.

Abstract

Kjerne histone octamers som gjentagelser fordelt langs en DNA-molekyl kalles nucleosomal arrays. Nucleosomal arrays oppnås på én av to måter: rensing fra in vivo-kilder, eller rekonstituering in vitro fra rekombinante kjerne histoner og tandem gjentas nukleosom posisjonering DNA. Den sistnevnte metode har fordelen av å tillate for sammenstilling av en mer ensartet sammensetningsmessig og nøyaktig plassert nucleosomal array. Sedimentehastighetsforsøk i den analytiske ultrasentrifuge utbytte informasjon om størrelsen og formen av makromolekyler ved å analysere den hastigheten som de vandrer gjennom løsningen under sentrifugalkraft. Denne teknikken, sammen med atomic force microscopy, kan anvendes for kvalitetskontroll, noe som sikrer at de fleste DNA-maler er mettet med nucleosomes etter rekonstituering. Her beskriver vi de protokoller som er nødvendige for å rekonstituere milligram mengder lengde og kompositorisk defined nucleosomal arrays egnet for biokjemiske og biofysiske studier av kromatin struktur og funksjon.

Introduction

Eukaryote genomer ikke eksistere som nakent DNA, men i stedet blir komprimert og organisert av bundne proteiner. Disse komplekser av DNA og protein er kjent som kromatin. Den grunnleggende repeterende enhet av kromatin er nucleosome. En nukleosom består av histone octamer og 146 basepar av DNA pakket rundt histone octamer ca 1,6 ganger en. Den histone octamer er sammensatt av to eksemplarer hver av kjerne histoner H2A, H2B, H3 og H4. Kjerne histone octamers som gjentagelser fordelt langs en DNA-molekyl kalles nucleosomal arrays. Den utvidede strukturen nucleosomal matriser er blitt referert til som 10 nm fiber eller "perler på en snor"-struktur, og er til stede in vitro ved lave saltforhold to. Den 10 nm fiber er i stand til kondensering inn i høyere ordens strukturer gjennom intra-matrisekompaktering og / eller inter-matrise 2-oligomerisering. Disse høyere ordens strukturer kan induseres i nærvær av salter,eller kan påvirkes gjennom binding av kromatin arkitektoniske proteiner til nucleosomal matrise 3,4. Nivåer av kromatin komprimering er omvendt korrelert med frekvensen av transkripsjon in vivo 5,6. Nyere forskning fremhever viktigheten av den strukturelle organiseringen av genomet ved prosesser slik som differensiering, kreftutvikling, og andre 7,8. Bruken av nucleosomal matriser for å studere kromatin struktur og funksjon er blitt utbredt. Her beskriver vi en metode for montering av nucleosomal arrays fra rekombinante kjerne histoner og nukleosom posisjonering DNA.

Ved hjelp av rekombinant DNA med tandem gjentar av nucleosome posisjonering sekvenser åpner for tilberedning av arrays som inneholder regelmessig avstand nucleosomes. To av de mer populære posisjonerings sekvenser er de 5S rRNA gensekvensen og "601"-sekvensen 9,10. Den 601-sekvensen ble avledet fra SELEX eksperimenter og more sterkt posisjonerer nucleosomes enn 5S sekvens 11. Følgelig er linker DNA lengden av de 601 rekker mer homogen. Tandem gjentas nukleosom posisjonering DNA oppnås ved gel filtrering 4,12. Rekombinante histoner er renset fra E. coli henhold denaturing forhold 13. Bruk av rekombinante histoner gjør det mulig å nøye kontrollere histone sammensetningen av nucleosomal matriser. For eksempel, histoner kjerne som bærer spesifikke mutasjoner 14 eller post-translasjonelle modifikasjoner 15,16 kan erstatte vill-type kjerne histoner.

Sedimentehastighetsforsøk overvåke hastigheten av sedimentering av makromolekyler i løsningen under et anvendt sentrifugalkraft 17.. Dette gir informasjon om størrelsen og formen av makromolekyler i en prøve. Sedimente velocity eksperimenter er dermed et egnet verktøy for å studere løsnings statlige endringer i kromatin fiberstruktur på grunn av kromatin kondens 18. Viktigere, er det først nødvendig å bruke sedimente velocity eksperimenter som en kvalitetskontroll skritt i nucleosomal rekke tilberedning. Dersom DNA og nucleosomes ikke er kombinert i rett molare forhold, kan oppstillingene være under-eller over-mettet med kjerne histoner. Således blir informasjonen oppnådd fra sedimentehastighetsforsøk benyttes til å sikre at DNA er riktig mettet med nucleosomes. Det er viktig å bruke alternative metoder for å beregne den metning av DNA med nucleosomes, spesielt hvis arbeide med en på forhånd uncharacterized DNA-templat. Derfor har vi også beskrive en metode for analyse av nucleosomal matriser ved hjelp atomic force mikroskopi (AFM). AFM er en kraftfull teknikk som tillater visualisering av virkningene av en rekke parametre, som for eksempel metningsnivået, effekten av tilstedeværelsen av histon-varianter eller virkningene av MgCl 2 19,20. AFM har også vært søkereed å studere nucleosome dynamikken bruke tid lapse bildebehandling 21. In vitro montert nucleosomal 12-mer arrays er spesielt mottagelig for AFM studier fordi de tilhører i riktig størrelse rekkevidde for AFM bildebehandling 22. I den foreliggende undersøkelse har vi benyttet AFM av nucleosomal matriser som en kvalitetskontroll, så vel som et middel til å bekrefte dataene fra AUC ("se er å tro"). I tillegg til enkel visualisering, tillater AFM måling av høydeprofiler av prøver som en ekstra beregning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Montering av rekombinant Kjerne Histoner inn Octamers

Begrunnelse: Det første trinnet i nucleosomal rekke rekonstituering er å forberede innfødte kjerne histone octamers fra frysetørrede rekombinante kjerne histoner. Histonproteinene er kombinert i like molare mengder, og satt sammen til histon octamers ved dialysering av prøvene ut av en denaturerende buffer til refolding buffer.

  1. Rens og Lyofiliser rekombinante kjerne histoner (H2A, H2B, H3, H4) som beskrevet 13.
  2. Oppløs ca 5 mg av hver lyofilisert kjerne histon i 3 ml av utfolding buffer (6 M guanidinium-HCl, 20 mM Tris pH 7,5, 5 mM DTT). Tillat hver prøve for å oppløse minst en time. Kontroller at ingen protein forblir på sidene av beholderen.
  3. Mål absorbansen til hver histone ved 276 nm ved hjelp av utfolding buffer som referanse.
  4. Beregn molariteten på hver histone ved hjelp av sine ekstinksjonskoeffisienter (Se tabell 1 Xenopus utryddelse histone koeffisienter). Sammenligne absorbansen bestemmes konsentrasjonen av histon til den lyofiliserte tørrvekt, og anslaget dersom flertallet av proteinet er oppløst.
  5. Bestem hvilke histone du har færrest mol, da dette vil være den begrensende antall føflekker for alle histoner.
  6. Kombiner de histoner i like molare mengder, og fortynn med utfolding buffer til en sluttkonsentrasjon på 1 mg / ml.
  7. Plasser prøven inn 6-8 kDa MWCO dialyserør. Forsegl røret og legger inn i 2 l kaldt refolding buffer (2 M NaCl, 10 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA, 5 mM β-merkaptoetanol).
  8. Dialyser prøven i 18 timer ved 4 ° C under omrøring. Sikre dialyserør kan rotere fritt og kraftig, eller annet de histoner kan utløse.
  9. Endre dialyse buffer to ganger i 18-timers periode (dvs. endre refolding buffer om hver 6 time til ferdig). Selv om bunnfallet dannes ikke kastprøven, kan noen octamer gjenopprettes selv om den effektive renten vil bli redusert.

Merk: Se trinn 2,1-2,2 å forberede kolonne vektutjevning for neste dag.

2. Rensing av Histone Octamers etter størrelse Exclusion Chromatography

Begrunnelse: Etter avsluttende med § 1, vil prøvene inneholder histone octamers samt andre histone komplekser som aggregater, H3/H4 tetramers og H2A/H2B dimer. Histone octamers vil bli renset bort fra disse andre komplekser som bruker størrelse utelukkelse kromatografi (SEC).

  1. Koble en HiLoad 16/60 Superdex200 16/60 (S200) kolonnen til en FPLC system. Sørg for at luftbobler ikke kommer inn i systemet.
  2. Rengjør S200 kolonnen med 0,2 mikrometer filtrert vann. Bruke en strømningshastighet på 0,3 ml / min, og sette en mottrykk grense på 0,5 MPa. Kontroller at du har nok vann og la kolonnen for å rense over natten.
  3. Stabil S200 kolonnen og prøve løkke av FPLS ved å bruke refolding buffer. Bruk en l på 0,2 um filtrert refolding buffer. Strømnings refolding buffer gjennom kolonnen med en hastighet på 1 ml / min, og et maksimalt trykk på 0,5 MPa i ca 2 timer.
  4. Stabil en Vivaspin sentrifugal konsentrator (50 kDa MWCO) med 1 ml av refolding buffer. Fjern prøven fra dialyserør og sentrifuger prøven ved 4 ° C for å fjerne bunnfall. Pipetter prøvesupernatant inn konsentratoren. Konsentrer prøven til et volum på omtrent 500 pl.
  5. Fjern konsentrert octamer prøven til en ny container og skyll konsentrator med en ml refolding buffer. Konsentrer skylle ned til 500 mL, og legge den til octamer prøven. Dette bidrar til å berge noen octamer igjen i konsentrator.
  6. Spin prøven i et 1,5 ml mikrosentrifugerør i 5 min ved 10 000 rpm ved 4 ° C. Samle supernatanten og overføre til et nytt rør. Dette bidrar til å fjerne ethvert bunnfall før du legger prøven på FPLC.
  7. Laste prøven på S200 kolonnen. Legg et maksimum på 1,5 ml samlet volum eller 15 mg octamer i en enkel rensing.
  8. Elueres prøven ved hjelp av nystekte refolding buffer. Bruke en strømningshastighet på 1 ml / min, og en rygg trykkgrense på 0,5 MPa. Bruk to kolonnevolumer (400 ml) refolding buffer og samle 2 ml fraksjoner. Overvåke absorbans ved 280 nm i løpet av elueringen. De ulike artene vil elueres etter synkende størrelse. Histone tilslag vanligvis elueres på ca 45 ml, octamer på ca 65 ml, og dimer på rundt 84 ml (figur 1).
  9. Analyser elueringsfraksjonene fra toppene av interesse ved å kjøre prøvene på en 18-20% SDS-PAGE. Fraksjoner inneholdende renset octamers skal ha like molare mengder av de fire kjerne histonproteinene (figur 1).
  10. Pool fraksjonene som inneholder renset octamers, og konsentrere seg til ≤ 15 mg / ml med en Vivaspin sentrifugalfilter. Hvis venstre fortynnet, kan octamers angre jegnto H2A/H2B dimer og H3/H4 tetramers.
  11. Bestem octamer konsentrasjon ved å måle absorbansen ved 280 nm, og beregning ved hjelp av ekstinksjonskoeffisient fra tabell 1.
  12. Histone octamers kan holdes kort sikt i refolding buffer ved 4 ° C. Ved å bli lagret i lengre tid, vil de octamers være mer stabil ved -20 ° C og i en 50% glycerol-løsning. Octamers lagret i glyserol bør dialyseres i frisk refolding buffer før absorpsjonsmålingene og bruk i nucleosomal matrise reconstitutions.

Tre. Tilberedning av Nucleosomal Arrays fra DNA og Purified Octamers

Begrunnelse: Tilberedning av nucleosomal arrays krever at histone octamers og mal DNA kombineres på bestemte molare forhold. Blandinger av DNA og histone octamers i 2 M NaCl er steg dialyseres inn buffere av avtagende ionestyrke. En gradvis endring til lavere salt sikrer riktig nukleosom formasjon. Innhenting nucleosomal arrays med ønsket nivå av histone octamer metning av malen DNA krever småskala test reconstitutions etterfulgt av en stor skala preparativ tilberedning. De aktuelle forholdene definert av småskala reconstitutions brukes til å veilede den forberedende tilberedning.

  1. Rens tandem gjentas nukleosom posisjonering DNA som beskrevet 4,12. Kort, isolere plasmid DNA ved hjelp av en Qiagen GigaPrep kit eller et lignende produkt. Sett opp en begrensning enzym fordøye for å frigjøre malen DNA og fordøye plasmid DNA til mindre størrelser (≤ 700bp). Den mal-DNA kan deretter bli renset bort fra de små plasmid-DNA ved hjelp av restene gelfiltrerings-kromatografi (SEC). En tyngdekraften mates kolonne med en høyde på omtrent 115 cm pakket med Sephacryl S-1000-perler er tilstrekkelig for rensning av 601 207bp x 12mer DNA.

Merknader: For plasmid DNA rensing på redusert pris, men økt effort, kan man bruke alkalisk lysis med fenol / kloroform DNA-rensing for å isolere plasmid-DNA fra E. coli 23,24. Strategier for separering av mal-DNA fra plasmid-DNA, kan variere med endringer i mal DNA størrelse. For SEC er det viktig å sette opp restriksjonsenzymet fordøye på en måte som maksimerer forskjellen i størrelse mellom malen og plasmid DNA.

  1. Bestemme hvilken molare forhold (r) som skal brukes for reconstitutions. R er lik forholdet mellom antall mol octamer til mol av DNA repeat. For første småskala forsøk, r verdier på 0,9, 1 og 1,1 er passende hvis hensikten er å få mettet nucleosomal arrays.
  2. Forbered liten skjellprøver ved å beregne mengden av octamer å legge til ca 18 mikrogram av DNA for hver molarforhold å bli testet. Bland DNA og histone octamers. Den endelige konsentrasjonen av NaCl i prøven bør ≥ 2 M, og den endelige konsentrasjon av DNA bør være rundt 0,3 mikrogram / mL. Den endelige prøvebuffer betingelser bør også inneholde 10 mM Tris pH 7,8, og 1 mM EDTA.
  3. Prøvene er nå klar for dialyse. Last inn prøvene til 12k-14k MWCO dialyserør. Dialyser prøvene mot 2L buffer synkende ionestyrke som følger.

Komponentene i alle buffere: 10 mM Tris pH 7,8, 1 mM EDTA. Buffer 1 (legg 1 M NaCl, 1 mM DTT) for 5-6 hr. Buffer 2 (legg 0,75 M NaCl, 1 mM DTT) over natten. Buffer 3 (legg 2,5 mM NaCl, 1 mM DTT) for 5-6 hr. Buffer 4 (tilsett 2,5 mM NaCl, 0,1 mM PMSF) over natten.

  1. Fjern prøvene fra dialyserør og fortsett til § 4-6. Hvis småskala prøvene gi de ønskede resultater, gjenta fremgangsmåten i § 3-6 på den store skalaen.

Merk: For å spare ressurser, bør prøvene småskala ha minimum volum er nødvendig for å være tilstrekkelig for nedstrøms screening-analyser. For å få enough prøven for sedimente hastighet og AFM eksperimenter som er oppført her, 50 ul prøver på 0,3 mg / ml DNA er hensiktsmessig. Størrelsen på stor skala, preparative eksempler er avhengig av den tiltenkte bruk. En stor skala prøven bør være forberedt på samme måte som de små skjellprøver.

4. Sedimente Velocity Analyse av rekonstituert Nucleosomal Arrays

Begrunnelse: Sedimentation hastighetsforsøk i Beckman Xl-A / I informasjonen analytisk ultrasentrifuge utbytte på størrelsen og formen av molekyler i oppløsning. Sedimente velocity eksperimenter utført under forhold med lite salt betingelser brukes til å bestemme i hvilken grad de rekonstituerte arrays er mettet med nucleosomes.

  1. Fortynn prøven til en absorbans rundt 0,5 ved 260 nm ved hjelp av TEN-buffer (10 mM Tris pH 7,8, 1 mM EDTA, 2,5 mM NaCl). Laste 400 pl av prøven inn i en celle med to sektormidtpunktet, med prøven på den ene side og referansesigce (TEN buffer) på den andre 25. Hold referanse menisk høyere enn prøven menisk (dvs. legge 420 mL referanseløsningen).
  2. Laste cellene inn i rotoren, og juster cellene riktig å bruke hash merker på bunnen av cellene og rotor 25. Forsiktig støv linser av cellene ved hjelp av trykkluft.
  3. Slå på XL-A/XL-I sentrifuge, setter rotoren, og feste og sikre optikk som beskrevet i manualen. Åpne Proteome Lab programvare og velg fil: ny.
  4. Sett opp en enkelt skanning kjøre på 3000 rpm og en temperatur på 25 ° C. Under alternativene velger stopp etter siste skanning, og kjøre radial kalibrering (radial kalibrering er ikke nødvendig dersom rotoren var den siste rotoren brukes i AUC).
  5. For hver celle, navn prøvene, velg en bølgelengde (260 nm), velg absorbans, og velg en lagre filen plassering på datamaskinen. Begynn enkelt skanning løp.
  6. Bruk enkelt skanning for å finne riktig radial scan lengde (Figur 2A). Reduksjon av lengden av cellen som skal skannes reduserer kjøretiden. Men husk å ta prøven menisken og forlenge slutt svært nær, eller i bunnen av cellen.

Merk: Enkelt skanninger tillate måling området som skal forkortes ved å starte målinger rett før prøven menisk (Figur 2A). De fleste av de skanninger som genereres under AUC løp bør ha grense fraksjoner forbi menisken, så vel som stabil platåer (figur 2B). Skitne linser på AUC-celler kan generere skanninger med stor stigning, kan disse påvirke analysen av dataene. Den Ultra programvaren inneholder en manual som er en stor ressurs for informasjon om analyse av analytiske ultra-sentrifuge data 26.

  1. Bruke XL-A/XL-I kontrollpanelet, skriv en hastighet på 0 og trykk start. Dette vil be sentrifugen kammer for å trekke et vakuum, og alleow temperaturen i kammeret for å stabilisere seg. Vent en time for å tillate for stabilisering av temperaturen før du starter et løp.
  2. Bruke programvaren til å sette løp for ønsket hastighet og antall skanninger. Høyere hastigheter øker oppløsning, men man skal samle minst 20 skanner (fortrinnsvis flere) før prøven har sedimentert til bunnen av cellen. Det er praktisk å overlappe de siste flere skanninger (oppnådd på alternativmenyen) for å overvåke fremdriften av kjøre og se etter potensielle problemer som lekker celler. Overvåke de første par skanner for å sikre forsvarlig drift.

5. Redigere og Analysere Sedimentasjon Velocity data

Begrunnelse: Raw sedimentehastighetsdata bør analyseres av et program som gir en diffusjonsåpen korrigert sedimentasjonskoeffesienter distribusjon. Denne informasjonen i sin tur angir brøkdelen av et rekonstituert prøve som inneholder et gitt metningsnivå, f.eks

  1. Bruk AUC dataanalyse programvare som Ultra å redigere dataene 26. Redigering av skannedata må gjøres for hver celle og skaper et datasett for senere analyse. Riktig redigering av skanninger består i å definere de eksempel menisk, redusere dataene til et område av interesse, og å definere referanse samt platå regioner (figur 2). Uønskede skanner kan også bli fjernet fra datasettet på dette punktet. Imidlertid, siden det er mulig å fjerne uønskede skanninger under analysen, er det anbefalt at alle skanninger holdes på dette punktet.
  2. Vi anbefaler sterkt at den forbedrede van Holde-Weischet metode brukes til å analysere dataene 27. Denne analysemetode korrigerer for effektene av diffusjon i løpet av kjøringen, og gir integralet fordeling av sedimente koeffisienter. Spesielt, Den forbedrede van Holde-Weischet metode (som implementert i Ultra) vil gi rom for inkludering av skanner som mangler stabile platåer, eller som inneholder grense fraksjoner som ikke har ryddet menisken i analysen 28.
  3. Bestem fordeling av sedimente koeffisienter for de sammensatte matriser. Representative resultater for 601-12 (207bp, 12-mer) nucleosomal matriser er vist i figur 3..
  4. Dersom en av de små skjellprøver inneholder matriser med ønsket utvalg av sedimente koeffisienter, deretter gjenta prosessen på en økt skala starter med § 3. Hvis ingen av de små skjellprøver har en riktig fordeling av sedimente koeffisienter deretter gjenta småskala tester med en ny r serien starter på kapittel 3.

6. Visualisering Nucleosomal Arrays Bruke Atomic Force Mikroskopi (AFM)

Begrunnelse: AFM tillater visualisering av metningsnivået av nukleosomformasjonl arrays. Denne teknikken utfyller sedimentehastighet ved AUC-og restriksjonsenzymfordøyelse og en kvalitetskontrollanalyse.

  1. Ved hjelp av fremgangsmåtene beskrevet ovenfor ved å skaffe en godt mettet nucleosome array (figur 5A).
  2. Forbered APTES behandlet glimmer slides ved å plassere ~ 30 pl 1:1.000 fortynning av kommersielt (Sigma-Aldrich (3-aminopropyl)-trietoksysilan A3648 100 ml) i 0,22 um filtrert nanopure vann i 30 min.
  3. Etter 30 min skyll APTES med filtrert vann og forsiktig tørke det i en nitrogenstrøm.
  4. Plasser riktig utvannet nukleosom rekke sample (~ 1,5 ng / mL) på lysbildet, og inkuber dekket ved romtemperatur i 15 min.
  5. Skyll prøve seg med filtrert prøvebuffer, tørke som før, og sted lysbilde på scenen av AFM (i dette tilfellet en Asylum Research MFP-3D Atomic Force Microscope).
  6. Begynn med CCD-2 x 2 mikrometer skanninger med 512 linjer. Tell antall nucleosomes å fastslå nivået av SAturation (Figur 5B).
  7. Ideelt sett bør du bildeområder på lysbildet med godt atskilt nucleosome arrays.
  8. For bilder med høyere oppløsning, kan en 500 x 500 nm scan oppnås (figur 5C).
  9. Bilder kan bli flatet ut og analysert ved hjelp av MFP-3D-programvare levert av Asylum.
  10. Hvert bilde kan deles inn i fire kvadranter og zoomet inn digitalt for å få et klarere syn på godt adskilt arrays og flere gratis juksa kan trekkes gjennom arrays og høydeprofiler oppnås for de nucleosomes (figur 5C, høyre panel-høyde spor og 5D).
  11. Flere slike bilder bør analyseres for hver type matrise som omfatter flere hundre nucleosomes. Høyde profiler blir registrert, kategorisert og plottet i MS Excel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å illustrere protokollen vi rekonstituerte nucleosomal arrays fra rekombinante Xenopus kjerne histoner og DNA som består av 12 tandem 207 bp gjentakelser av 601 posisjonering sekvens (601 207 x 12). Vi først montert innfødte octamers fra frysetørrede kjerne histoner og deretter renset de octamers etter FPLC hjelp av en S200 kolonne (figur 1A). Større komplekser elueres tidligere fra S200 kolonnen. Histoner generelt elueres i denne rekkefølgen: uspesifikke histone aggregater, histone octamer, H3/H4 tetramer, og H2A/H2B dimer (figur 1A). Toppene fra S200-kolonnen, ble analysert ved SDS-PAGE. De geler av renset octamer fraksjoner bør indikere ekvimolare mengder av de fire histonproteinene (figur 1B). Merk at Xenopus H2A og H2B har molekylvekter som avviker med bare ca 200 DA og dermed de vises som en enkelt band på SDS gels. H3/H4 tetramers og H2A/H2B dimers vil elueres etter, men very nær histone octamer topp. Når du velger hvilke fraksjoner for å holde det er klokt å forkaste fraksjoner vises mot slutten av octamer topp i kromatogrammet. Disse fraksjoner kan ha en forøket mengde av ikke-oktamer histon komplekser. I dette tilfelle fraksjoner 64-67 ble slått sammen og lagret for nucleosomal matrise oppløsning (figur 1).

Innen Ultra det er to forskjellige måter å se spredningen korrigert distribusjon av sedimente koeffisienter som er hentet fra den forbedrede van Holde-Weischet analyse. Den røde linje representerer integralet fordeling av sedimente koeffisienter. For hvilken som helst gitt punkt på grafen, viser y-aksen andelen av prøven som har et sedimentasjon-koeffisient som er lik eller mindre enn verdien som er angitt på x-aksen. Således er en vertikal linje indikerer en homogen prøve, mens en heterogen prøve vil ha en kurve med positiv helning. Den grønne linjen er dederivat av integrert distribusjon. Arealet under en topp er proporsjonal med fraksjonen av prøven som har det sedimente koeffisient. Fullt mettet 601 207 x 12 nucleosomal arrays har en sedimentasjonskoeffesienter av 29S 29. For eksemplet vist på figur 3, de data som indikerer at omtrent 70% av de matriser er mettet og 30% er overmettet.

Atomic force mikroskopi har gått fra en voksende teknikk til en populær komplementær tilnærming for å studere kromatin organisasjon in vitro. Her har vi brukt AFM sammen av analytisk ultracentrifugation å etablere omfanget av malen metning etter tilberedning. I figur 6 flertallet av ~ 27s arrays (figur 4A) som brukes for avbildning inneholdt 10-11 nucleosomes (Figur 4B), noe som viser utmerket samsvar mellom AFM og AUC-resultatene. AFM resultater oppnådd her dermed validere dettenærme seg og gjøre det til en pålitelig teknikk for å karakterisere nucleosomal arrays.

Histone Protein Σ276, utfoldet Proteiner cm -1 M -1 Molekylvekt Da
H2A 4350 13960
H2B 7250 13774
H3 4640 15273
H4 5800 11236
Octamer 44080 108486

Tabell 1. Ekstinksjonskoeffisienter og molekylvekt av Xenopus laevis kjerne histoner og renatureres histone octamer.

Figur 1
Figur 1. A. elueringsprofil fra S200 kolonnen som beskrevet i § 2. Den lille topp på ca 44 ml skyldes store histone aggregater. Den fremtredende topp på 67 ml er de histone octamers. Den brede skuld 76-90 ml inneholder H3/H4 tetramers og H2A/H2B dimer. B. 20% SDS-PAGE av utvalgte fraksjoner fra S200 kolonnen. Tidlige fraksjoner fra octamer peak bør samles som de er minst sannsynlig å bli forurenset av de ikke-oktamer histone komplekser. I dette tilfellet fraksjoner 64-67 ble samlet og lagret for nucleosomal rekke tilberedning. Klikk her for å se større figur .

Fig. 2
Figur 2. A. ProteomeLab programvare skjermen fange av en enkelt skanning samlet på 3000 rpm (med label lagt til). Merk at prøven ikke sediment på dette lav hastighet. Singelen skanning brukes til å angi omfanget av målinger for AUC celle scan (trinn 4.6). B. Skjermen fange av en serie av sedimente velocity skanner innhentet ved hjelp av Ultra program (med etiketter lagt) 26. Denne serien av skanninger redigeres for å generere et sett data for analyse (se trinn 5.1).

Figur 3
Figur 3. Et skjermbilde fra UltraScanII. De røde og grønne linjer er to forskjellige metoder for å se på fordelingen av sedimente koeffisienter i Ultra. Den røde linje er integrert fordeling av sedimente koeffisienter, samtidig som den grønne er den deriverte. Ekstra informasjon om tolkning kan bli funnet i resultatene delen.


Figur 4. AFM. A. Sedimentehastighetsprofil for 601 207 x 12 matriser sammenføyd med mus octamer indikerer den gjennomsnittlige sedimente koeffisienten er 27S. B. De samme matriser i A ble fotografert ved AFM og antallet nucleosomes telles i flere bilder ble plottet i Microsoft Excel. Tomten indikerte at et flertall av arrays hadde 10-11 nucleosomes som bekrefter AUC-data. C. A 500 ​​x 500 nm skanning av 601 207 x 12 nucleosome arrays med linker DNA godt synlig. Øverst til høyre panel er amplitude spor og midten høyre panel er den fasen spor for matrisen vist i C. Nederst til høyre panel er i samme høyde spor vist til venstre, men med en ledig hånd linje trukket gjennom nucleosomes å bestemme høyden profil av nukleosoms. D. Høyde profiler av nucleosomes i bildet over viser at alle nucleosomes varierer innenfor 1,5-2,5 nm høyde som tidligere rapportert 40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Modell nucleosomal arrays er et svært nyttig verktøy for in vitro studie av kromatin struktur og funksjon. For eksempel har de vært mye brukt for å studere mekanismen for kromatin fiber kondensasjon i løsning 30 til 34, og gjorde det mulig å oppnå et røntgenstruktur av et tetranucleosome 35.. Mer nylig har de vist seg nyttig i å tyde de strukturelle effekter av spesifikke kjerne histone varianter, mutanter og posttranslational modifikasjoner 14-16,36. Her beskriver vi en generell metode for montering av modell nucleosomal arrays fra nukleosom posisjonering DNA og rekombinante kjerne histoner.

Den tilberedning av nucleosomal arrays fra renset octamers og 601 207 x 12 DNA er grei, involverer flere dialyse trinn som sekvensielt senke NaCl konsentrasjon fra 2 M til 2,5 mM. Den vanskeligste delen av protokollen er å bruke en r-verdi som gir den ønskede template metningsnivå. Den passende R-verdien blir først bestemt empirisk i liten skala, og deretter gjentatt i større skala for å generere de nucleosomal matriser som benyttes for eksperimenter. I vårt tilfelle ble vi forsøker å få 601 207 x 12 DNA maler for det meste mettet med 12 nucleosomes per DNA. Den sedimentasjonskoeffesienter av et fullt mettet 601 207 x 12 nucleosomal matrise er 29 S, mens den samme DNA mal med bare 11 nucleosomes pr DNA sedimentene på ~ 27S 29. Således sedimente hastighet i den analytiske ultrasentrifuge gir en meget følsom fremgangsmåte for å bestemme nucleosome metningsnivået etter rekonstituering. Vi har analysert våre data ved hjelp av den forbedrede van Holde-Weischet metoden, som gir en diffusjon-korrigert sedimentasjonskoeffesienter distribusjon. Denne informasjonen er viktig fordi den forteller en hvordan homogen eller heterogen prøven er etter tilberedning. Med andre ord, for en 601 x 207 12 DNA-templat, denindikerer den brøkdel av prøven som har 12 nucleosomes pr DNA, 11 nucleosomes pr DNA, osv. Figur 3 viser resultatene av den forbedrede van Holde-Weischet analyse av 601 207 x 12 nucleosomal matriser rekonstituert i en r på 1,1, der omtrent 30% av de matriser er overmettet. Nytten av prøven er vanligvis knyttet til prosentandelen av mettede matriser, men er avhengig av forsøkene matriser vil bli brukt i. Noen anvendelser kan kreve meget homogene og / eller mettede matriser. En rekke metoder finnes for å forbedre homogeniteten og metning av nucleosomal matriser.

I dette tilfelle de overmettede matriser kan fjernes ved selektiv utfelling ved tilsetning av MgCl 2 37. Mer homogene matriser kan også oppnås ved å rense prøven ved hjelp av sukrose-gradient sentrifugering, preparativ gel-elektroforese, og ionebytterkromatografi 10,13. En modifisert nucleosomal rekke rekonstituering metodekall for å legge kort konkurrent DNA til prøvene før tilberedning gjennom salt dialyse 38,39. Dette gjør det mulig å montere nucleosomal matriser med et overskudd av histon octamer uten over metning av DNA-templat. Nucleosomal matriser rekonstituert ved hjelp av konkurrent-DNA vil trolig kreve et rensetrinn for fjerning av konkurrent-DNA og ekstra histoner.

Selv etter å ha liten skala pilotmatriseelementer, er det mulig at nucleosomal arrays rekonstituert i stor skala vil ikke bli skikkelig mettet. For å unngå å kaste bort en templat DNA og histon octamer i prøven, er det mulig å feste over-eller under mettede matriser. Dersom arrays er over mettet, kan ekstra-DNA tilsettes til prøven. Hvis arrays er under mettet, kan ekstra octamer legges til rette det opp. Men, legger octamer til arrays allerede dialysert inn i lav salt kan føre octamer dissosiasjon. Hvis du legger ekstra octamer eller DNA til matriser, dialyser arrays tilbake i 2 M NaCl før du legger ekstra octamer eller DNA til samleprøven. Gjenta trinn dialyse for faste prøver fra høy til lav salt pr trinn 3.4. Mengden av octamer å legge i for å korrigere arrays kan estimeres fra sedimente koeffisienter for under mettede arrays 29. Etter justering av prøven til nucleosomal matriser, bør målinger av metningsnivå gjøres en gang til.

Mens AFM er en kraftig metode for å karakterisere nucleosomal matriser, er det komplisert og arbeidskrevende prosess. Dette gjør den til en dårlig teknikk for screening småskala reconstitutions, men en utmerket teknikk for karakterisering av prøver store og for studiet av kromatin organisasjon. Tidligere har vi brukt AFM å visualisere "makro" partikler som genereres av en macroH2A sletting konstruere som var "hyper-responsive" til selv lave MgCl2 konsentrasjoner. LikewiSE, Montel et al. (2009) har vist at H2A BBD variant fører nucleosome arrays for å være mer "åpen" i forhold til villtype arrays. Derfor er AFM en pålitelig teknikk for kvalitetskontroll samt for studiet av kromatin fiberstruktur i sin alminnelighet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NIH tilskudd GM45916 og GM66834 til JCH og et fellesskap fra den internasjonale Retts syndrom Foundation til AK Dette arbeidet ble også støttet av NIH gi GM088409 og Howard Hughes Medical Institute bidrag til KL

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-Aminopropyl)triethoxysilane Sigma-Aldrich A3648-100ML
6-8 kDa MWCO Dialysis Tubing Fisher 21-152-5
HiLoad Superdex 200 16/60 Column GE 17-1069-01
Vivaspin 50 kDa MWCO Centrifugal Concentrator Sartorius VS2031
12-14 kDa MWCO Dialysis Tubing Fisher 08-667A
Illustra Sephacryl S-1000 Superfine GE 17-0476-01
XL-A/I Analytical Ultracentrifuge Beckman-Coulter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Luger, K., Mader, A., Richmond, R., Crystal Sargent, D. structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 7, (1997).
  2. Hansen, J. C. Conformational dynamics of the chromatin fiber in solution: determinants, mechanisms, and functions. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 31, 361-392 (2002).
  3. McBryant, S., Adams, V., Hansen, J. Chromatin architectural proteins. Chromosome Research. 14 (1), 39-51 (2006).
  4. Hansen, J. C., Ausio, J., Stanik, V. H., van Holde, K. E. Homogeneous reconstituted oligonucleosomes, evidence for salt-dependent folding in the absence of histone H1. Biochemistry. 28 (23), 9129-9136 (1989).
  5. Szerlong, H. J., Prenni, J. E., Nyborg, J. K., Hansen, J. C. Activator-dependent p300 acetylation of chromatin in vitro: enhancement of transcription by disruption of repressive nucleosome-nucleosome interactions. The Journal of Biological Chemistry. 285 (42), 31954-31964 (2010).
  6. Cirillo, L. A., Lin, F. R., Cuesta, I., Friedman, D., Jarnik, M., Zaret, K. S. Opening of compacted chromatin by early developmental transcription factors HNF3 (FoxA) and GATA-4. Molecular Cell. 9 (2), 279-289 (2002).
  7. Nguyen, C., Gonzales, F. chromatin structure associated with methylation-induced gene silencing in cancer cells: correlation of accessibility, methylation, MeCP2 binding and acetylation. Nucleic Acids Research. 29 (22), 4598-4606 (2001).
  8. Cuesta, I., Zaret, K. S., Santisteban, P. The forkhead factor FoxE1 binds to the thyroperoxidase promoter during thyroid cell differentiation and modifies compacted chromatin structure. Molecular and Cellular Biology. 27 (20), 7302-7314 (2007).
  9. Simpson, R. T., Stafford, D. W. Structural features of a phased nucleosome core particle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 80 (1), 51-55 (1983).
  10. Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
  11. Lowary, P., Widlund, H., Cao, H. Sequence motifs and free energies of selected natural and non-natural nucleosome positioning DNA sequences. Journal of Molecular Biology. 288, 213-229 (1999).
  12. Gordon, F., Luger, K., Hansen, J. C. The Core Histone N-terminal Tail Domains Function Independently and Additively during Salt-dependent Oligomerization of Nucleosomal Arrays *. The Journal of Biological Chemistry. 280 (40), 33701-33706 (2005).
  13. Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Expression and purification of recombinant histones and nucleosome reconstitution. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 119 (4), 1-16 (1999).
  14. McBryant, S. J., Klonoski, J., et al. Determinants of histone H4 N-terminal domain function during nucleosomal array oligomerization: roles of amino acid sequence, domain length, and charge density. The Journal of Biological Chemistry. 284 (25), 16716-16722 (2009).
  15. Ma Shogren-Knaak,, Fry, C. J., Peterson, C. L. A native peptide ligation strategy for deciphering nucleosomal histone modifications. The Journal of Biological Chemistry. 278 (18), 15744-158 (2003).
  16. Lu, X., Simon, M. The effect of H3K79 dimethylation and H4K20 trimethylation on nucleosome and chromatin structure. Nat Struct Mol Biol. 15 (10), 1122-1124 (2008).
  17. Ausio, J. Analytical Ultracentrifugation for the Analysis of Chromatin Structure. Biophysical Chemistry. 86 (2-3), 141-153 (2000).
  18. Hansen, J., Kreider, J., Demeler, B., Fletcher, T. Analytical ultracentrifugation and agarose gel electrophoresis as tools for studying chromatin folding in solution. Methods. 12 (1), 62-72 (1997).
  19. Montel, F., Menoni, H., et al. The dynamics of individual nucleosomes controls the chromatin condensation pathway: direct atomic force microscopy visualization of variant chromatin. Biophysical Journal. 97 (2), 544-5453 (2009).
  20. Muthurajan, U. M., McBryant, S. J., Lu, X., Hansen, J. C., Luger, K. The linker region of macroH2A promotes self-association of nucleosomal arrays. The Journal of Biological Chemistry. 286 (27), 23852-23864 (2011).
  21. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of nucleosomes revealed by time-lapse atomic force microscopy. Biochemistry. 48 (33), 7842-7848 (2009).
  22. Lohr, D., Bash, R., Wang, H., Yodh, J., Lindsay, S. Using atomic force microscopy to study chromatin structure and nucleosome remodeling. Methods (San Diego, Calif). 41 (3), 333-341 (2007).
  23. Dyer, P. N., Edayathumangalam, R. S., et al. Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA. Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).
  24. Sambrook, J., Russell, D. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  25. Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. Assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell. J. Vis. Exp. (33), e1530 (2009).
  26. Demeler, B. UltraScan: a comprehensive data analysis software package for analytical ultracentrifugation experiments. Modern Analytical Ultracentrifugation: Techniques. , 210-230 (2005).
  27. Holde, K. V., Weischet, W. Boundary analysis of sedimentation velocity experiments with monodisperse and paucidisperse solutes. Biopolymers. 17 (6), 1387-1403 (1978).
  28. Demeler, B., van Holde, K. E. Sedimentation velocity analysis of highly heterogeneous systems. Analytical Biochemistry. 335, 279-288 (2004).
  29. Hansen, J., Lohr, D. Assembly and structural properties of subsaturated chromatin arrays. Journal of Biological Chemistry. 8, 5840-5848 (1993).
  30. Routh, A., Sandin, S., Rhodes, D. Nucleosome repeat length and linker histone stoichiometry determine chromatin fiber structure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 105 (26), 8872-8877 (2008).
  31. Zhou, J., Fan, J. Y., Rangasamy, D., Tremethick, D. J. The nucleosome surface regulates chromatin compaction and couples it with transcriptional repression. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (11), 1070-1076 (2007).
  32. Dorigo, B., Schalch, T., Kulangara, A., Duda, S., Schroeder, R. R., Richmond, T. J. Nucleosome arrays reveal the two-start organization of the chromatin fiber. Science (New York, N.Y.). 306 (5701), 1571-1573 (2004).
  33. Correll, S. J., Schubert, M. H., Grigoryev, S. a Short nucleosome repeats impose rotational modulations on chromatin fibre folding. The EMBO Journal. 31 (10), 2416-2426 (2012).
  34. Mcbryant, S. J., Krause, C., Woodcock, C. L., Hansen, J. C. The Silent Information Regulator 3 Protein , SIR3p , Binds to Chromatin Fibers and Assembles a Hypercondensed Chromatin Architecture in the Presence of Salt. Molecular and Cellular Biology. 28 (11), 3563-3572 (2008).
  35. Schalch, T., Duda, S., Sargent, D. F., Richmond, T. J. X-ray structure of a tetranucleosome and its implications for the chromatin fibre. Nature. 436 (7047), 138-1341 (2005).
  36. Fan, J. Y., Gordon, F., Luger, K., Hansen, J. C., Tremethick, D. J. The essential histone variant H2A.Z regulates the equilibrium between different chromatin conformational states. Nature Structural Biology. 9 (3), 172-176 (2002).
  37. Carruthers, L. M., Bednar, J., Woodcock, C. L., Hansen, J. C. Linker histones stabilize the intrinsic salt-dependent folding of nucleosomal arrays: mechanistic ramifications for higher-order chromatin folding. Biochemistry. 37 (42), 14776-14787 (1998).
  38. Huynh, V. A. T., Robinson, P. J. J., Rhodes, D. A Method for the In Vitro Reconstitution of a Defined "30 nm" Chromatin Fibre Containing Stoichiometric Amounts of the Linker Histone. Journal of Molecular Biology. 345 (5), 957-968 (2005).
  39. Dorigo, B., Schalch, T. Chromatin fiber folding: requirement for the histone H4 N-terminal tail. J. Mol. Biol. 2836 (03), 85-96 (2003).
  40. Qian, R. L., Liu, Z. X., et al. Visualization of chromatin folding patterns in chicken erythrocytes by atomic force microscopy (AFM. Cell Research. 7 (2), 143-150 (1997).

Tags

Cellular Biology Kromosom Structures Kromatin Nucleosomes Histoner Mikroskopi Atomic Force (AFM) biokjemi Kromatin nukleosom Nucleosomal Array Histone Analytical ultracentrifugation Sedimente Velocity
Montering av Nucleosomal Arrays fra Rekombinant kjerne Histoner og nukleosom Positioning DNA
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rogge, R. A., Kalashnikova, A. A.,… More

Rogge, R. A., Kalashnikova, A. A., Muthurajan, U. M., Porter-Goff, M. E., Luger, K., Hansen, J. C. Assembly of Nucleosomal Arrays from Recombinant Core Histones and Nucleosome Positioning DNA. J. Vis. Exp. (79), e50354, doi:10.3791/50354 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter