En imagerie calcique in vivo des neurones en C. elegans

Summary

Avec son petit corps, transparent et documenté neuroanatomie et une foule de techniques génétiques qui se prêtent et réactifs,<em> C. elegans</em> Fait un organisme modèle idéal pour<em> In vivo</em> Imagerie neuronale utilisant relativement simples et peu coûteuses techniques. Nous décrivons ici l'imagerie seul neurone dans les animaux adultes intacts génétiquement codés à l'aide des indicateurs de calcium fluorescentes.

Abstract

Le ver nématode C. elegans est un organisme modèle idéal pour relativement simple, l'imagerie à faible coût neuronale in vivo. Son petit corps transparentes et simples, bien caractérisé le système nerveux permet l'identification et l'imagerie de fluorescence d'un neurone à l'intérieur de l'animal intact. Techniques d'immobilisation simples avec un impact minimal sur la physiologie de l'animal permettent prolongée imagerie time-lapse. Le développement de fluorophores calcium génétiquement encodés sensibles tels que cameleon ¹ et ² GCaMP permettre l'imagerie in vivo de calcium neuronal concernant la physiologie cellulaire et l'activité neuronale. De nombreuses souches transgéniques exprimant ces fluorophores dans des neurones spécifiques sont facilement disponibles ou peuvent être construits en utilisant des techniques bien établies. Ici, nous décrivons des procédures détaillées pour la mesure dynamique du calcium dans un seul neurone in vivo en utilisant à la fois GCaMP et caméléon. Nous discutons des avantages et des disadvantles âges de deux, ainsi que diverses méthodes de préparation des échantillons (immobilisation des animaux) et l'analyse d'image. Enfin, nous présentons les résultats de deux expériences: 1) Utilisation GCaMP pour mesurer la réponse d'un neurone sensoriel spécifique à un champ électrique externe et 2) Utilisation cameleon pour mesurer la réponse physiologique de calcium d'un neurone à l'endommagement laser traumatique. Techniques d'imagerie calcique comme ceux-ci sont largement utilisés dans C. elegans et ont été étendues aux mesures chez les animaux se déplaçant librement, les neurones multiples simultanément et de comparaison entre fonds génétiques. C. elegans présente un système robuste et flexible pour l'imagerie neuronale in vivo avec des avantages par rapport aux systèmes d'autres modèles de simplicité et de coût.

Introduction

Nous présentons ici des méthodes pratiques pour l'imagerie in vivo de calcium dans C. neurones elegans. Le développement de la codés génétiquement sensible au calcium avec une grande fluorophores signal sur bruit rend C. elegans un système relativement simple et rentable pour la mesure de la neurophysiologie et de l'activité. Notre formation d'image est effectuée avec un microscope standard à l'aide d'imagerie à grand champ de fluorescence des fluorophores couramment disponibles. Nous présentons plusieurs techniques employant différents fluorophores et la préparation des échantillons différents, de discuter les forces et les faiblesses de chacun. Les données sont ensuite présentées à partir de deux expériences exemple. Une excellente ressource supplémentaire sur les techniques décrites ici peuvent être trouvés dans WormBook, "Imagerie l'activité des neurones et les muscles" de R. Kerr, ( http://www.wormbook.org ) ^3.

Deux grandes classes d'génétiquementment codées reporters fluorescents de calcium sont couramment utilisés dans C. elegans: GCaMP seul canal et FRET à base de cameleon. Nous allons décrire les méthodes et montrer des exemples de données générés par chacun.

GCaMP est basé sur une modification de la protéine fluorescente verte (GFP) qui est sensible à la concentration de calcium environnante. Ceci est réalisé par fusion de la GFP et de la calmoduline de calcium de haute affinité protéine, de telle sorte que la fixation du calcium par la calmoduline de la molécule apporte une confirmation dans la GFP efficace fluorescent ^2. Les récents progrès dans ces fluorophores générer taille exceptionnelle du signal avec une augmentation jusqu'à 500% de l'intensité de fluorescence dans une gamme physiologique de la calcémie et de la cinétique relativement rapide de ~ 95 ms de temps de montée et temps de descente ~ 650 msec ^4. Sur des périodes de temps relativement courtes (minutes), ces signaux peuvent permettre grandes pour l'imagerie basse résolution (faible grossissement) et, étant donné un sage init amesure de référence ial, nier la nécessité pour base continue ou mesures comparatives.

Cameleon a l'avantage d'être un fluorophore FRET basée sur une mesure qui génère ratiométrique comparaison de deux canaux indépendants ou longueurs d'onde ^1. Il se compose de deux fluorophores séparés (cyan et jaune émettant des protéines fluorescentes, CFP et YFP) reliés par une protéine calmoduline. Le complexe est éclairé par la lumière bleue (440 nm) qui excite la PCP. Fixation du calcium apporte les fluorophores se rapprocher, ce qui augmente le transfert d'énergie de fluorescence par résonance (FRET) à partir de la PCP (donneur) de la YFP (accepteur) et provoquer l'émission de la PCP (480 nm) et pour diminuer l'émission YFP (535 nm) pour augmenter . Le taux de calcium relatifs sont mesurés par le rapport de l'intensité de la YFP / PCP. Cameleon cinétique est plus lente que celle de GCaMP, mesurée in vivo pour avoir un temps de montée d'environ 1 s et un temps de décroissance de 3 ~ ⁵ sec. Cependant,le rapport des signaux en opposition mobiles augmente la taille du signal et pour compenser un certain nombre d'objets possibles à cause de changements de concentration en fluorophore, de mouvement ou de la dérive et de mise au point de blanchiment.

Génétiquement codés rapporteurs fluorescents annuler une grande partie de la préparation des échantillons avec des sondes exogènes administrées et C. elegans petit corps transparent permet l'imagerie chez l'animal intact en utilisant de simples fluorescence large champ. Le principal défi technique dans la préparation des échantillons est donc d'immobiliser les animaux en toute sécurité. Il ya un certain nombre de différentes techniques couramment utilisées chacune avec des avantages et des inconvénients. L'utilisation d'un agent pharmacologique de paralyser les animaux est facile à mettre en œuvre et permet le montage de plusieurs animaux sur une préparation (lévamisole, un agoniste cholinergique qui provoque le tissu musculaire à saisir est généralement utilisé ^6). C. elegans peut aussi être physiquement immobilisé par leur montagele raide 10% d'agarose ^{7, 8.} Cet impact réduit sur la physiologie des animaux, permet à long terme d'imagerie (heures) et la récupération de plusieurs animaux, mais est techniquement plus difficile. Ces deux techniques limiter l'accès physique aux animaux (qui sont sous une lamelle) et ne peut donc être utilisé avec certains stimuli expérimentaux (tels que la lumière, la température, champ électrique ou de dommage au laser). Pour les stimuli où l'accès physique est nécessaire, comme le toucher ou l'administration de produits chimiques, de nombreuses études ont réussi à coller C. elegans en place (en utilisant de la colle d'vétérinaire) ^9. Ce qui est techniquement plus difficile, est une préparation unique animal et ne permet pas la récupération des animaux. Enfin, de nombreux dispositifs microfluidiques ont été employées que physiquement contre C. elegans, la préservation de la physiologie animale, ce qui permet une exposition à la plupart des types de stimuli (en fonction de la conception du dispositif) et peut permettre l'échange rapide et de récupération des animaux <sup> 10, 11. Cependant microfluidique besoin d'autres compétences techniques et des capacités dans la conception, la fabrication et la mise en œuvre. L'activité animaux immobilisés et de relance de réponse peut généralement être mesurée en sensoriels et des interneurones. L'activité des neurones moteurs nécessite des techniques plus sophistiquées d'imagerie chez l'animal en mouvement. Ici, nous allons présenter les méthodes détaillées utilisant les deux techniques les plus simples de la paralysie pharmacologique et immobilisation rigide agarose.

Les méthodes présentées ici peuvent être utilisés pour mesurer l'activité neuronale et la physiologie des cellules de C. elegans. Nous donnons un exemple de chaque: en utilisant GCaMP pour mesurer la réponse du neurone sensoriel ASJ à un champ électrique externe, et en utilisant cameleon pour mesurer la réponse physiologique au calcium endommagement laser d'un neurone. Ces exemples montrent les avantages et les inconvénients des deux types de fluorophores et d'illustrer ce qui est possible avec le système.

Protocol

1. Configuration optique Utiliser un microscope composé standard avec des capacités d'imagerie à épifluorescence. Nous utilisons un Nikon Eclipse Ti-U microscope inversé avec un illuminateur Intensilight HG. Pour une meilleure qualité d'image et du signal utiliser un fort grossissement, objectif haute ouverture numérique. Nous utilisons généralement un Nikon X60 1.4 Objectif NA immersion dans l'huile. Dans certains cas, il est possible d'utiliser plus faible grossissement (X…

Representative Results

Nous présentons ici les résultats de deux expériences distinctes. Le premier emploie GCaMP pour mesurer la réponse d'un neurone sensoriel spécifique à un stimulus externe définie, ce qui donne un bon exemple de la façon dont les journalistes de calcium fluorescents peuvent être utilisés pour surveiller optiquement l'activité neuronale dans intacts C. elegans. La seconde emploie cameleon pour mesurer le calcium intracellulaire transitoire déclenché dans le neurone en réponse aux dommages la…

Discussion

Indicateurs de calcium génétiquement codés ont été largement utilisés dans C. elegans neurobiologie. De nombreux groupes ont utilisé ces techniques pour étudier la réponse des neurones sensoriels primaires à des stimuli externes comme démontré ici avec la réponse ASJ à un champ électrique. Exemples les plus notables figurent sensation du toucher mécanique, des produits chimiques spécifiques, de la température et un champ électrique ^{12, 16-19.} L'activité des interneurones et le…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Eclipse Ti-U inverted microscope	Nikon
Intensilight HG Illuminator	Nikon	C-HGFI	Fluorescent light source
CFI Plan Apo VC 60X Oil	Nikon
Optical table or 3’X3′ optical grade breadboard	Thor Labs		If an optical table is not used an optical grade breadboard on a solid laboratory bench should suffice.
Clara Interline Camera	Andor Technology		High-sensitivity CCD camera
wtGFP Longpass Emission	Chroma Technology Corp.	41015	GFP filter set for imaging GCaMP
Filter 440 +/- 10 nm	Chroma	D440/20x EX	excitation filter for cameleon
Dichroic mirror > 455 nm longpass	Chroma	455DCLP BS	microscope dichroic for cameleon imaging
Dichroic mirror > 515 nm longpass	Chroma	515DCLP BS	dichroic mirror for cameleon imaging
Filter 535 +/- 15 nm	Chroma	D535/30m EM	YFP emission filter
Filter 480 +/- 20 nm	Chroma	D485/40m EM	CFP emission filter
Lens, 200 mm, Achromat	Thor Labs	AC508-200-A1	Relay lens for FRET optics (3)
Silver broadband mirror	Thor Labs	ME2S-P01	FRET optics (2)
NGM buffer
Levamisole	Sigma
Polybead Microspheres	Polysciences, Inc.	08691-10, 2.5% by volume, 50 nm diameter	polystyrene nanoparticles for C. elegans immobilization
Transgenic strain, Strain gpa-9::GCaMP3(in pha-1; him-5 bkg)	Sternberg Lab	Strain PS6388
Transgenic strain, mec- 4::YC3.60	Gabel Lab	Strain CG1B