In vivo imaging di calcio neuronale in C. elegans
Summary
Con il suo piccolo corpo trasparente, ben documentato neuroanatomia e una serie di tecniche genetiche suscettibili e reagenti,<em> C. elegans</em> Rende un organismo modello ideale per<em> In vivo</em> Di imaging neuronale utilizzando relativamente semplici, tecniche a basso costo. Qui si descrive l'imaging singolo neurone in animali adulti intatti usando geneticamente codificati indicatori di calcio fluorescenti.
Abstract
Il verme nematode C. elegans è un organismo modello ideale per relativamente semplice, a basso costo di imaging neuronale in vivo. Suo piccolo corpo trasparente e semplice, ben caratterizzato sistema nervoso consente l'identificazione e l'imaging di fluorescenza di ogni neurone all'interno dell'animale intatto. Tecniche di immobilizzazione semplici con un impatto minimo sulla fisiologia dell'animale consentono esteso time-lapse imaging. Lo sviluppo di geneticamente codificati fluorofori calcio sensibili come cameleon 1 e 2 permettono GCaMP immagini in vivo di calcio neuronale relative sia fisiologia cellulare e l'attività neuronale. Numerosi ceppi transgenici che esprimono questi fluorofori in neuroni specifici sono prontamente disponibili o possono essere costruiti utilizzando tecniche ben consolidate. Qui si descrivono le modalità dettagliate per la misura della dinamica del calcio all'interno di un singolo neurone in vivo usando sia GCaMP e cameleon. Discutiamo vantaggi e disadvantetà di entrambi, nonché vari metodi di preparazione del campione (immobilizzazione animale) e analisi di immagine. Infine, vengono presentati i risultati di due esperimenti: 1) Uso GCaMP per misurare la risposta sensoriale di un neurone specifico ad un campo elettrico esterno e 2) Uso cameleon misurare la risposta fisiologica di calcio di un neurone laser a danni traumatici. Tecniche di imaging di calcio come questi sono ampiamente utilizzati in C. elegans e sono stati estesi alle misure in animali liberi di muoversi, i neuroni contemporaneamente e confronto tra background genetico. C. elegans presenta un sistema robusto e flessibile per imaging in vivo neuronale con vantaggi rispetto ad altri sistemi modello semplicità tecnica e costo.
Introduction
Qui vi presentiamo metodi pratici per imaging in vivo di calcio in C. elegans neuroni. Lo sviluppo di geneticamente codificati calcio-sensibili fluorofori con elevato rapporto segnale-rumore rende C. elegans un sistema relativamente semplice e conveniente per la misurazione di neurofisiologia e di attività. La nostra immagine è fatta con un microscopio standard con largo campo imaging di fluorescenza dei fluorofori comunemente disponibili. Vi presentiamo diverse tecniche che impiegano fluorofori diversi e preparati di campionamento diverse, discutendo i punti di forza e di debolezza di ciascuno. I dati vengono quindi presentato da due esperimenti di esempio. Una risorsa eccellente aggiuntiva sulle tecniche descritte qui possono essere trovati in WormBook, "Imaging l'attività dei neuroni e dei muscoli" di R. Kerr, ( http://www.wormbook.org ) 3.
Due classi principali di geneticamenteautomaticamente codificati reporter calcio fluorescenti sono comunemente usati in C. elegans: GCaMP singolo canale e FRET-based cameleon. Noi descrivere i metodi e mostrare esempi di dati generati da ciascuna.
GCaMP si basa su una modifica proteina fluorescente verde (GFP), che è sensibile alla concentrazione di calcio circostante. Questo viene realizzato per fusione GFP e la elevata affinità calmodulina calcio proteina, in modo tale che il legame del calcio da calmodulina porta la molecola di GFP in una conferma efficiente fluorescente 2. I recenti progressi in questi fluorofori generano dimensioni eccezionali del segnale fino a 500% di aumento di intensità di fluorescenza in un range fisiologico dei livelli di calcio e cinetica ragionevolmente veloci di ~ 95 msec tempo di salita e tempo di decadimento ~ 650 msec 4. In periodi di tempo relativamente brevi (minuti), questi segnali di grandi dimensioni può consentire l'imaging risoluzione più bassa (inferiore ingrandimento) e, dato un bravo initmisurazione di riferimento ial, negare la necessità di base continuo o misurazioni comparative.
Cameleon ha il vantaggio di essere un FRET-based fluoroforo che genera una misurazione raziometrica confrontando due canali indipendenti o lunghezze d'onda 1. Si compone di due fluorofori distinti (proteine fluorescenti-ciano e giallo-emissione, CFP e YFP) collegati da una proteina calmodulina. Il complesso è illuminata con luce blu (440 nm) che eccita la PCP. Il legame di calcio porta i fluorofori più vicini, aumentando Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) dal CFP (donatore) alla YFP (accettore) e causando l'emissione PCP (480 nm) per diminuire l'emissione e YFP (535 nm) per aumentare . Relativi livelli di calcio sono misurati come rapporto della YFP / CFP intensità. Cinetica Cameleon sono lento di quello di GCaMP, misurata in vivo per avere un tempo di salita di ~ 1 sec ed un tempo di decadimento di ~ 3 sec 5. Tuttavia,il rapporto dei segnali contrapposti mobili aumenta la dimensione del segnale e compensa una serie di possibili artefatti dovuti ai cambiamenti nella concentrazione fluoroforo, movimento o deriva fuoco e candeggio.
Geneticamente codificati reporter fluorescenti negare gran parte della preparazione del campione richiesto con esogena sonde amministrati e C. elegans piccolo corpo trasparente permette l'imaging nel intatta di un animale con semplice fluorescenza ampio campo. La principale sfida tecnica nella preparazione del campione è quindi sicuro per immobilizzare gli animali. Ci sono un certo numero di differenti tecniche comunemente utilizzate ciascuno con vantaggi e svantaggi. Utilizzando un agente farmacologico di paralizzare gli animali è facile da implementare e permette il montaggio di animali multiple su una preparazione (Levamisole, un agonista colinergico che causa tessuto muscolare cogliere viene tipicamente usato 6). C. elegans può anche essere fisicamente immobilizzato da montarliil rigida 10% agarosio 7, 8. Questo impatto minimizza sulla fisiologia degli animali, consente a lungo termine di imaging (ore) e il recupero di animali di più, ma è tecnicamente più difficile. Entrambe queste tecniche limitare l'accesso fisico agli animali (che sono sotto un coprioggetto) e può quindi essere utilizzata solo con determinati stimoli sperimentali (come luce, temperatura, campo elettrico o danni laser). Per stimoli in cui è necessario l'accesso fisico, come il tatto o la somministrazione di prodotti chimici, molti studi hanno successo incollato C. elegans in atto (con colla veterinario grado) 9. Questo è tecnicamente più impegnativo, è una preparazione singolo animale e non consente il recupero degli animali. Infine, numerosi dispositivi microfluidici sono stati impiegati che fisicamente trattenere C. elegans, preservando fisiologia animale, permettendo l'esposizione alla maggior parte di stimoli (a seconda del modello del dispositivo) e può permettere lo scambio rapido e recupero degli animali <sup> 10, 11. Tuttavia microfluidica richiedono ulteriori competenze tecniche e capacità nella progettazione, fabbricazione e realizzazione. In immobilizzato attività animali e stimolo risposta può generalmente essere misurato in sensoriale e interneuroni. Attività dei neuroni motori richiede tecniche più sofisticate per immagini negli animali in movimento. Qui presenteremo metodi dettagliati che impiegano i due tecniche più semplici di paralisi farmacologica e immobilizzazione rigida con agarosio.
I metodi presentati qui possono essere usati per misurare l'attività neuronale e fisiologia cellulare in C. elegans. Diamo un esempio di ciascuna: utilizzando GCaMP per misurare la risposta sensoriale del neurone ASJ ad un campo elettrico esterno, e utilizzando cameleon per misurare la risposta fisiologica di calcio al danno laser di un neurone. Questi esempi mostrano i vantaggi e gli inconvenienti dei due tipi di fluorofori e illustrare cosa è possibile con il sistema.
Protocol
Representative Results
Discussion
Indicatori calcio geneticamente codificati sono stati ampiamente utilizzati in C. elegans neurobiologia. Numerosi gruppi hanno utilizzato queste tecniche per studiare la risposta dei neuroni sensitivi primari a stimoli esterni come dimostrato qui con la risposta ASJ ad un campo elettrico. Esempi più evidenti riguardano sensazione del tatto meccanici, prodotti chimici specifici, la temperatura e un campo elettrico 12, 16-19. Attività di interneuroni e cellule muscolari sono stati monitorati sia in r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Molte persone hanno contribuito al lavoro descritto in questo articolo. CVG ha costruito il setup sperimentale, e LS, SHC, e CVG eseguito gli esperimenti. CVG e SHC ha scritto il manoscritto. Tutti gli autori successivamente preso parte al processo di revisione e approvato la copia definitiva del manoscritto. Ringraziamo Paul Sternberg per il ceppo GCaMP. Alcuni ceppi di nematodi utilizzati in questo lavoro sono stati forniti dal Centro di Genetica Caenorhabditis (CGC), che è finanziato dalla National NIH Center for Research (NCRR). Il programma di analisi di immagine MATLAB è stato adattato da quello utilizzato in 18. Gli autori sono stati sostenuti da Boston University e il Massachusetts Life Sciences Center.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Eclipse Ti-U inverted microscope |
Nikon | ||
| Intensilight HG Illuminator | Nikon | C-HGFI | Fluorescent light source |
| CFI Plan Apo VC 60X Oil | Nikon | ||
| Optical table or 3’X3′ optical grade breadboard |
Thor Labs | If an optical table is not used an optical grade breadboard on a solid laboratory bench should suffice. |
|
| Clara Interline Camera | Andor Technology |
High-sensitivity CCD camera | |
| wtGFP Longpass Emission | Chroma Technology Corp. |
41015 | GFP filter set for imaging GCaMP |
| Filter 440 +/- 10 nm | Chroma | D440/20x EX | excitation filter for cameleon |
| Dichroic mirror > 455 nm longpass |
Chroma | 455DCLP BS | microscope dichroic for cameleon imaging |
| Dichroic mirror > 515 nm longpass |
Chroma | 515DCLP BS | dichroic mirror for cameleon imaging |
| Filter 535 +/- 15 nm | Chroma | D535/30m EM | YFP emission filter |
| Filter 480 +/- 20 nm | Chroma | D485/40m EM | CFP emission filter |
| Lens, 200 mm, Achromat | Thor Labs | AC508-200-A1 | Relay lens for FRET optics (3) |
| Silver broadband mirror | Thor Labs | ME2S-P01 | FRET optics (2) |
| NGM buffer | |||
| Levamisole | Sigma | ||
| Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 08691-10, 2.5% by volume, 50 nm diameter |
polystyrene nanoparticles for C. elegans immobilization |
| Transgenic strain, Strain gpa-9::GCaMP3(in pha-1; him-5 bkg) |
Sternberg Lab | Strain PS6388 | |
| Transgenic strain, mec- 4::YC3.60 |
Gabel Lab | Strain CG1B |
References
- Miyawaki, A., Llopis, J., Heim, R., McCaffery, J. M., Adams, J. A., Ikura, M., Tsien, R. Y. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).
- Kerr, R. Imaging the activity of neurons and muscles. WormBook. , (2006).
- Tian, L., Hires, S. A., Mao, T., Huber, D., Chiappe, M. E., Chalasani, S. H., Petreanu, L., Akerboom, J., McKinney, S. A., Schreiter, E. R., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875 (2009).
- Reiff, D. F., Ihring, A., Guerrero, G., Isacoff, E. Y., Joesch, M., Nakai, J., Borst, A. In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies. J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).
- Rand, J. B. Acetylcholine. WormBook. , (2005).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization. PLoS ONE. 8 (1), e53419 (2013).
- Byrne, A. B., Edwards, T. J., Hammarlund, M. In vivo Laser Axotomy in C. elegans. J. Vis. Exp. (51), e2707 (2011).
- Kerr, R., Lev-Ram, V., Baird, G., Vincent, P., Tsien, R. Y., Schafer, W. R. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4, 727-731 (2007).
- Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans. Lab. Chip. 7, 1515-1523 (2007).
- Gabel, C. V., Gabel, H., Pavlichin, D., Kao, A., Clark, D. A., Samuel, A. D. Neural circuits mediate electrosensory behavior in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 27, 7586-7596 (2007).
- Pinan-Lucarre, B., Gabel, C. V., Reina, C. P., Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Slone, R. D., Xue, J., Qiao, Y., Weisberg, S., Roodhouse, K., et al. The Core Apoptotic Executioner Proteins CED-3 and CED-4 Promote Initiation of Neuronal Regeneration in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 10, e1001331 (2012).
- Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation. BMC Neurosci. 7, 30 (2006).
- Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10554-10559 (2004).
- Kindt, K. S., Quast, K. B., Giles, A. C., De, S., Hendrey, D., Nicastro, I., Rankin, C. H., Schafer, W. R. Dopamine mediates context-dependent modulation of sensory plasticity in C. elegans. Neuron. 55, 662-676 (2007).
- Chalasani, S. H., Chronis, N., Tsunozaki, M., Gray, J. M., Ramot, D., Goodman, M. B., Bargmann, C. I. Dissecting a circuit for olfactory behaviour in Caenorhabditis elegans. Nature. 450, 63-70 (2007).
- Clark, D. A., Gabel, C. V., Gabel, H., Samuel, A. D. Temporal activity patterns in thermosensory neurons of freely moving Caenorhabditis elegans encode spatial thermal gradients. J. Neurosci. 27, 6083-6090 (2007).
- Biron, D., Shibuya, M., Gabel, C., Wasserman, S. M., Clark, D. A., Brown, A., Sengupta, P., Samuel, A. D. A diacylglycerol kinase modulates long-term thermotactic behavioral plasticity in C. elegans. Nat. Neurosci. 9, 1499-1505 (2006).
- Ghosh-Roy, A., Wu, Z. L., Goncharov, A., Jin, Y. S., Chisholm, A. D. Calcium and Cyclic AMP Promote Axonal Regeneration in Caenorhabditis elegans and Require DLK-1 Kinase. Journal of Neuroscience. 30, 3175-3183 (2010).
- Bianchi, L., Gerstbrein, B., Frokjaer-Jensen, C., Royal, D. C., Mukherjee, G., Royal, M. A., Xue, J., Schafer, W. R., Driscoll, M. The neurotoxic MEC-4(d) DEG/ENaC sodium channel conducts calcium: implications for necrosis initiation. Nat. Neurosci. 7, 1337-1344 (2004).
