A Novel<em> Ex vivo</em> Cultuur Methode voor de embryonale Mouse Hart
Summary
Ontwikkelingsstudies in de muis worden gehinderd door de ontoegankelijkheid van het embryo tijdens de dracht. Om de lange termijn cultuur van het embryonale hart te bevorderen in de late stadia van de zwangerschap, hebben we een protocol waarin het uitgesneden hart wordt gekweekt in een semi-vaste, verdunde Matrigel ontwikkeld.
Abstract
Ontwikkelingsstudies in de muis worden gehinderd door de ontoegankelijkheid van het embryo tijdens de dracht. Aldus protocollen het isoleren en kweken individuele organen plaats zijn essentieel voor een werkwijze voor het visualiseren van zowel veranderingen in de ontwikkeling en waardoor nieuwe behandelingsstrategieën bieden. Om de lange termijn cultuur van het embryonale hart te bevorderen in de late stadia van de zwangerschap, hebben we een protocol waarin het uitgesneden hart wordt gekweekt in een semi-vaste, verdunde Matrigel ontwikkeld. Dit substraat verschaft voldoende steun aan de driedimensionale structuur te behouden, maar is flexibel genoeg om verdere krimp mogelijk. In het kort, worden harten uitgesneden uit het embryo en in een mengsel van koude Matrigel 1:1 verdund met kweekmedium. Na het verdunde Matrigel stolt, wordt groeimedium toegevoegd aan de kweekschaal. Harten uitgesneden zo laat embryonale dag 16,5 levensvatbaar waren voor vier dagen na de dissectie. Analyse van de coronaire plexus blijkt dat deze methode nietverstoren coronaire vasculaire ontwikkeling. Zo presenteren we een nieuwe werkwijze voor de lange termijn kweek van embryonale hart.
Introduction
De afgelopen jaren heeft de transgene muis is het overheersende modelsysteem voor het bestuderen van de ontwikkeling hartafwijkingen. Echter, andere modelorganismen, zoals de zebravis, bewezen aanzienlijke voordelen boven de muis hebben. Drie belangrijke voordelen van de zebravis zijn de externe leggen van eieren, voor gemakkelijke toegang tot de embryo, de optische transparantie van de embryo's die eenvoudige visualisatie van de ontwikkeling van het hart toelaten, en het gemak van aanbrengen van kleine moleculaire behandelingen te moduleren ontwikkeling van het embryo 1. Aldus zou de ontwikkeling van een cultuur techniek die ex utero groei van een embryonale orgaan toegestaan omzeilen, althans gedeeltelijk, de beperkingen vandaag op onderzoekers die de ontwikkeling in transgene muizen.
Ex vivo cardiale kweek zijn ontwikkeld in zowel het kuiken en muisembryo dat behandeling met kleine moleculen en analyse van de ver mogelijklende regio's van het hart te communiceren 2-6. Voor geheel muizenhart cultuur, harten die uit embryo's tot embryonale (E) 12.5 van leeftijd kan in kweekmedium geplaatst worden met of zonder schommelen 2,3,5. Met deze techniek, zijn embryonale harten succes geïncubeerd om de gelijkwaardigheid van E13.5 en harten gekweekt met schudden werden wel drie dagen (vanaf E10.5) 3 gehandhaafd. Er zijn echter geen studies meldde de succesvolle cultuur van de harten van oudere embryo's. Ook hebben reddingsexperimenten beperkt tot de toepassing van de therapeutische agens wereldwijd aan het kweekmedium 2.
Een plak kweeksysteem waarin harten uitgesneden, ingebed en coupes met een vibratome is ook gebruikt bij jongere harten, zoals E12.5 muisharten en Hamburger-Hamilton stage 36 (ongeveer E16 in de muis) chick hearts 2,4,6, en ouder harten, zoals postnatale en volwassen muis hearts en volwassen menselijke harten 7,8. Terwijl de embryonale analyses hebben doorgaans gebruikt 150-urn dikke secties 2,4, kan snijdikte een groot als 500 micrometer zijn zonder bewijs van zuurstoftekort 8. Deze slice culturen zijn gehandhaafd zolang twee maanden in de cultuur, met de meeste schijfjes behoud contractiliteit in deze periode 9. Vergeleken met studies in geïsoleerde cardiomyocyten, die slice culturen kan de co-cultuur van cardiomyocyten met naburige celtypes en een bruikbare werkwijze voor ex vivo analyse. Echter, deze culturen vereisen uitgebreidere opstelling dan simpelweg plaatsen van een hart in kweekmedium (bijv. inbedding het levende hart voor het snijden op vibratome) en de analyses is uiteraard beperkt tot het gedeelte van het hart binnen het gedeelte.
Gezien de bovenstaande beperkingen voor het kweken van embryonale muis harten en de rijkdom van de transgene muizen available voor studie, hebben we een ex vivo muizenhart cultuur systeem vergelijkbaar met een ex vivo long kweeksysteem ontwikkeld door Weaver ontwikkeld, et al.. 10 Onze cultuur systeem maakt op lange termijn de cultuur en de visualisatie van de verbouwing coronaire circulatie binnen hele embryonale muis harten. Bovendien, het gebruik van Matrigel kunnen kralen worden vastgehouden in het hart, waardoor een gelokaliseerde behandeling met therapeutische middelen. Deze experimenten kunnen op verschillende ontwikkelingsstadia tijdstippen worden uitgevoerd om het effect van een bepaalde behandeling te vergelijken op een werkwijze zoals coronaire formatie. Omdat kleine moleculen kunnen diffunderen door Matrigel, kan deze cultuur systeem ook gebruikt worden om de cultuur ontleed regio's van het hart bij elkaar om te bepalen of specifieke cel-cel contacten die nodig zijn voor bepaalde ontwikkelingsprocessen of dat paracrienen van de ene regio naar de andere is zijn noodzakelijk.
Deze cultuur systeemis relatief eenvoudig en, in tegenstelling tot de slice kweeksysteem maakt gebruik van basiscultuur reagentia en configuraties die gemakkelijk beschikbaar in de meeste laboratoria. In het kort, worden uitgesneden embryonale hart gekweekt in verdunde Matrigel, waar semi-vaste drager verschaft. Deze steun is voldoende om de driedimensionale morfologie van het hart te handhaven en daarbij tevens het hart samentrekken. Met dit systeem kan geheel harten van oudere muizen embryo's (E14.5-E16.5) in cultuur worden gehandhaafd voor maximaal vier dagen. De gehele coronaire plexus wordt gehandhaafd, in tegenstelling tot in de slice culturen, zodat eventuele signalering signalen die zich voordoen tussen de verschillende regio's van het hart aanwezig blijven. Bovendien kunnen levende cellen fluorescerende kleurstoffen het Matrigel doordringen tot visualisatie van de levende hart toe, en proteïne-geconjugeerde kralen kunnen in de buurt van het hart worden geplaatst om een gelokaliseerde signalering bron bieden. Samen zijn deze voordelen maken deze techniek een ideale methode voor het bestuderen van ontwikkelingsprocessen in de embryonic muis hart.
Protocol
Representative Results
Discussion
De huidige cultuur systeem vormt significante voordelen voor de embryonale muis hart onderzoeken. Deze cultuur systeem bewaart myocardcontractiliteit en de coronaire plexus, met beperkte tekenen van necrose, zelfs na vier dagen in de cultuur. Verder, de halfvaste matrix bevat voldoende steun aan de driedimensionale morfologie van het ontwikkelen van hart behouden terwijl flexibiliteit contract en om beklede kralen tijdens kweek op zijn plaats. Desondanks steun, deze matrix is permeabel voor fluorescente kleurstoff…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij willen Andrea Portbury bedanken voor het kritisch lezen van het manuscript en het NIH (subsidie # R01HL061656) voor financiële steun.
Materials
| REAGENTS | |||
| Timed-pregnant mice | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| PBS (1x) | |||
| DMEM | Cellgro | ||
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | BD Bioscience | 356231 | |
| Syto-16 | Invitrogen | S7578 | Used as directed in 13 |
| 24-well culture plate | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| EQUIPMENT | |||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Cell culture incubator | Thermo | 3110 |
References
- Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects. Differentiation. 84, 4-16 (2012).
- Lavine, K. J., et al. Fibroblast growth factor signals regulate a wave of Hedgehog activation that is essential for coronary vascular development. Genes Dev. 20, 1651-1666 (2006).
- Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464, 549-553 (2010).
- Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation. Dev. Biol. 255, 334-349 (2003).
- Zhang, J., et al. The FGF-BMP signaling axis regulates outflow tract valve primordium formation by promoting cushion neural crest cell differentiation. Circ. Res. 107, 1209-1219 (2010).
- Pillekamp, F., et al. Establishment and characterization of a mouse embryonic heart slice preparation. Cellular Physiology and Biochemistry: international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 16, 127-132 (2005).
- Habeler, W., Peschanski, M., Monville, C. Organotypic heart slices for cell transplantation and physiological studies. Organogenesis. 5, 62-66 (2009).
- Janssen, P. M., Lehnart, S. E., Prestle, J., Hasenfuss, G. Preservation of contractile characteristics of human myocardium in multi-day cell culture. J. Mol. Cell Cardiol. 31, 1419-1427 (1999).
- Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovasc. Res. 93, 50-59 (2012).
- Weaver, M., Dunn, N. R., Hogan, B. L. Bmp4 and Fgf10 play opposing roles during lung bud morphogenesis. Development. , 127-2695 (2000).
- Viragh, S., Challice, C. E. The origin of the epicardium and the embryonic myocardial circulation in the mouse. Anat. Rec. 201, 157-168 (1981).
- Kirby, M. L. . Cardiac Development. , (2007).
- Arima, S., et al. Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement. Development. 138, 4763-4776 (2011).
