A Novel<em> Ex vivo</em> Metodo di Cultura per il mouse embrionale del cuore
Summary
Studi di sviluppo nel topo sono ostacolati dalla inaccessibilità dell'embrione durante la gestazione. Per promuovere la cultura a lungo termine del cuore embrionale in fase avanzata di gestazione, abbiamo sviluppato un protocollo in cui il cuore asportato è colto in un semi-solido, Matrigel diluito.
Abstract
Studi di sviluppo nel topo sono ostacolati dalla inaccessibilità dell'embrione durante la gestazione. Così, protocolli di isolare e cultura singoli organi di interesse sono essenziali per fornire un metodo di entrambe visualizzando cambiamenti nello sviluppo e consentendo nuove strategie terapeutiche. Per promuovere la cultura a lungo termine del cuore embrionale in fase avanzata di gestazione, abbiamo sviluppato un protocollo in cui il cuore asportato è colto in un semi-solido, Matrigel diluito. Questo substrato fornisce supporto sufficiente per mantenere la struttura tridimensionale, ma è sufficientemente flessibile per consentire una continua contrazione. In breve, i cuori sono tagliate dal embrione e collocate in una miscela di Matrigel freddo diluito 1:1 con terreno di crescita. Dopo la Matrigel diluito solidifica, è aggiunto terreno di crescita al piatto cultura. Cuori asportati il più tardi giorno embrionale 16,5 erano vitali per quattro giorni dopo la dissezione. Analisi del plesso coronarico dimostra che questo metodo noninterrompere lo sviluppo vascolare coronarico. Così, presentiamo un nuovo metodo per coltura a lungo termine di cuori embrionali.
Introduction
Negli ultimi anni, il topo transgenico è stato il sistema modello per lo studio predominante difetti cardiaci sviluppo. Tuttavia, altri organismi modello, come il pesce zebra, hanno dimostrato di avere vantaggi significativi rispetto al mouse. Tre vantaggi principali del zebrafish sono la posa esterna delle uova, per facilità di accesso alle embrioni; la trasparenza ottica degli embrioni, che permette una facile visualizzazione di sviluppo cardiaco, e la facilità di applicazione piccole trattamenti molecolari per modulare sviluppo dell'embrione 1. Pertanto, lo sviluppo di una cultura tecnica che ha permesso ex crescita in utero di un organo embrionale sarebbe bypassare, almeno in parte, le limitazioni attualmente sperimentato dai ricercatori che studiano i processi dello sviluppo in topi transgenici.
Sistemi di coltura ex vivo cardiaci sono stati sviluppati sia nella pulcino ed embrione di topo che permettono il trattamento con piccole molecole e analisi di come differenti regioni del cuore comunicano 2-6. Per tutta la cultura del cuore del mouse, cuori prelevati da embrioni fino a embrionale (E) 12,5 di età può essere posizionato in terreno di coltura con o senza dondolo 2,3,5. Usando questa tecnica, cuori embrionali sono state incubate con successo per l'equivalenza di E13.5 e cuori coltura con dondolo sono stati mantenuti fino a tre giorni (partendo E10.5) 3. Tuttavia, nessuno studio ha riportato la cultura di successo di cuori da embrioni anziani. Allo stesso modo, gli esperimenti di salvataggio è stata limitata ad applicare l'agente terapeutico globalmente al mezzo di coltura 2.
Un sistema di coltura fetta, in cui i cuori sono asportati, incorporati e sezionato con un vibratome, è stato anche utilizzato per entrambi i cuori più giovani, come E12.5 i cuori del mouse e Hamburger-Hamilton stadio 36 (circa E16 nel topo) pulcino cuori 2,4,6, e più cuori, come il post-natale e di topo adulto hearts e cuori umani adulti 7,8. Mentre le analisi embrionali sono tipicamente utilizzate sezioni spesse 150 micron 2,4, spessore della sezione può essere un grande come 500 micron senza evidenza di privazione di ossigeno 8. Queste culture fetta sono state mantenute fino a due mesi di cultura, con la maggior parte delle fette mantenendo contrattilità in tutto questo periodo 9. Rispetto agli studi in cardiomiociti isolati questi culture fetta consentono il co-coltura di cardiomiociti con i loro tipi di cellule adiacenti e forniscono un metodo utile per l'analisi ex vivo. Tuttavia, queste colture richiedono più elaborato set-up che semplicemente posizionando un cuore in mezzo di coltura (per es incorporamento cuore vivo per il sezionamento su un vibratome), e ogni analisi è ovviamente limitata alla porzione del cuore all'interno della sezione.
Date le limitazioni sopra descritte per la coltura di embrioni cuori del mouse e la ricchezza di topi transgenici available per lo studio, abbiamo sviluppato un sistema di coltura del mouse cuore ex vivo simile a un sistema di coltura polmone ex vivo sviluppato da Weaver, et 10 Il nostro sistema di cultura al. permette cultura a lungo termine e la visualizzazione della circolazione coronarica rimodellamento all'interno interi embrionali cuori del mouse. Inoltre, l'utilizzo di Matrigel permette perline per essere tenute in posizione vicina al cuore, fornendo così un trattamento localizzato con agenti terapeutici. Questi esperimenti possono essere eseguiti a differenti tempi di sviluppo per confrontare l'effetto di un dato trattamento su un processo come la formazione di arteria coronaria. Perché le piccole molecole possono diffondere attraverso Matrigel, questo sistema di coltura può essere utilizzato anche per la cultura regioni sezionati del cuore vicino all'altro per determinare se specifici contatti cellula-cellula sono necessarie per alcuni processi di sviluppo o se segnalazione paracrina da una regione all'altra è necessario.
Questo sistema di colturaè relativamente semplice e, a differenza del sistema di coltura fetta, fa uso di reagenti cultura di base e set-up che sono facilmente reperibili nella maggior parte dei laboratori. In breve, cuori embrionali escisse sono coltivate in Matrigel diluito, che fornisce un semi-solido supporto. Questo supporto è sufficiente a mantenere la morfologia tridimensionale del cuore permettendo anche la contrazione del cuore. Utilizzando questo sistema, cuori interi da anziani embrioni di topo (E14.5-E16.5) possono essere mantenute in coltura per un massimo di quattro giorni. L'intero plesso coronario è mantenuto, a differenza delle culture fetta, quindi eventuali spunti di segnalazione che si verificano da diverse regioni del cuore rimangono presenti. Inoltre, coloranti fluorescenti live-cellulari possono permeare la Matrigel per permettere la visualizzazione del cuore in diretta, e perle di proteine coniugate possono essere collocati in prossimità del cuore di fornire una fonte di segnalazione localizzata. Insieme, questi vantaggi fanno di questa tecnica un metodo ideale per lo studio dei processi di sviluppo in embryonic cuore del mouse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il sistema attuale cultura pone vantaggi significativi per gli studi embrionali cuore del mouse. Questo sistema di coltura preserva contrattilità miocardica e il plesso coronario, con segnali limitati di necrosi, anche dopo quattro giorni di coltura. Inoltre, la matrice semi-solido fornisce supporto sufficiente a mantenere la morfologia tridimensionale del cuore di sviluppo pur consentendo flessibilità per contratto e anche per tenere perline rivestite in posizione durante cultura. Nonostante questo sostegno, questa m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare Andrea Portbury per la lettura critica del manoscritto e del NIH (borsa # R01HL061656) per il supporto finanziario.
Materials
| REAGENTS | |||
| Timed-pregnant mice | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| PBS (1x) | |||
| DMEM | Cellgro | ||
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | BD Bioscience | 356231 | |
| Syto-16 | Invitrogen | S7578 | Used as directed in 13 |
| 24-well culture plate | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| EQUIPMENT | |||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Cell culture incubator | Thermo | 3110 |
References
- Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects. Differentiation. 84, 4-16 (2012).
- Lavine, K. J., et al. Fibroblast growth factor signals regulate a wave of Hedgehog activation that is essential for coronary vascular development. Genes Dev. 20, 1651-1666 (2006).
- Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464, 549-553 (2010).
- Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation. Dev. Biol. 255, 334-349 (2003).
- Zhang, J., et al. The FGF-BMP signaling axis regulates outflow tract valve primordium formation by promoting cushion neural crest cell differentiation. Circ. Res. 107, 1209-1219 (2010).
- Pillekamp, F., et al. Establishment and characterization of a mouse embryonic heart slice preparation. Cellular Physiology and Biochemistry: international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 16, 127-132 (2005).
- Habeler, W., Peschanski, M., Monville, C. Organotypic heart slices for cell transplantation and physiological studies. Organogenesis. 5, 62-66 (2009).
- Janssen, P. M., Lehnart, S. E., Prestle, J., Hasenfuss, G. Preservation of contractile characteristics of human myocardium in multi-day cell culture. J. Mol. Cell Cardiol. 31, 1419-1427 (1999).
- Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovasc. Res. 93, 50-59 (2012).
- Weaver, M., Dunn, N. R., Hogan, B. L. Bmp4 and Fgf10 play opposing roles during lung bud morphogenesis. Development. , 127-2695 (2000).
- Viragh, S., Challice, C. E. The origin of the epicardium and the embryonic myocardial circulation in the mouse. Anat. Rec. 201, 157-168 (1981).
- Kirby, M. L. . Cardiac Development. , (2007).
- Arima, S., et al. Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement. Development. 138, 4763-4776 (2011).
