Выделение Родные почвенных микроорганизмов с потенциалом для Breaking Down биоразлагаемых пластиковых Фильмы Мульча используется в сельском хозяйстве

Summary

Полимерные пленки с надписью "биоразлагаемый" коммерчески доступны для сельскохозяйственного использования в качестве мульчи. Почвы представляет собой привлекательный методом удаления, но деградация в полевых условиях еще плохо изучены. Целью данного исследования была разработка методов выделения родной почвенные грибы и бактерии, которые колонизировали пластиковые пленки мульчу после полевых захоронения.

Abstract

Грибы рода сельскохозяйственных почв, что колонизировали коммерчески доступных биоразлагаемых мульчи (BDM) фильмов были выделены и оцениваются на предмет потенциального деградировать пластмасс. Как правило, когда составы пластмасс известны и источника сырья доступно, порошкообразный пластик может быть приостановлено в агар на основе информации и деградации путем визуального очистки зон. Однако такой подход плохо имитирует на месте деградации BDMs. Во-первых, BDMs не диспергирован в виде мелких частиц всей почвенной матрице. Во-вторых, BDMs не поставляется на рынок как чистых полимеров, а скорее как пленок, содержащих добавок (например, наполнители, пластификаторы и красители), которые могут влиять на рост микроорганизмов. Процедуры, описанные здесь были использованы штаммы получены из почвы похоронен фильмов мульчи. Грибковые штаммы получены из раскопанных BDMs были протестированы индивидуально для роста на куски новых, дезинфицируют BDMs уложенной поверх определенной среде, не содержащей электронной источника углеродаxcept агара. Изоляты, которые росли на BDMs далее испытывали в жидкой среде, где BDMs были единственным добавил источник углерода. После примерно десяти недель, грибковые колонизации и БДМ деградацию оценены с помощью сканирующей электронной микроскопии. Изоляты были идентифицированы с помощью анализа последовательности гена рибосомной РНК. Это сообщение описывает методы грибковых изоляции, а также бактерии были изолированы с помощью этих методов заменой среды подходит для бактерий. Наша методика должна оказаться полезной для исследования, изучающие разбивка нетронутыми пластиковые пленки или продукты, для которых пластиковые сырье или неизвестны или недоступны. Однако наш подход не обеспечивает количественный метод сравнения цены деградации БДМ.

Introduction

Деградация исторически считается нежелательным атрибутом пластичных полимеров, так как разбивка продукт сокращает срок службы и долговечность. Недавно осведомленности об экологических проблемах представленных пластиковых отходов в природной среде ^1,2,3 сделал биоразлагаемых пластиков привлекательной альтернативой обычным пластмасс. Деградация (определяется как структурные изменения, фрагментация и снижению молекулярной массы, целостность и прочность ^4,5) происходит через ряд событий, в том числе и абиотических процессов (тепловой стресс, фото-окисление, гидролиз, эрозии и механических напряжений), и биологической деградации ^6. В то время как абиотических процессов может изменить размер фрагмента и характеристик пластмасс, микроорганизмы, необходимые для их конечной минерализации воды и углекислого газа (в аэробных условиях) и / или метана (в анаэробных условиях).

Значительная нишу длябиоразлагаемых пластмасс существует в сельском хозяйстве, где пластиковой мульчи используются для предотвращения роста сорняков, чтобы сохранить влажность почвы и увеличению температуры почвы ^7,8. Сотни тысяч гектаров в одних только Соединенных Штатах прикрыты пластиковыми мульчи ^9, в том числе мульчи состоит из биоразлагаемых пластиковых. После вегетационный период сельскохозяйственных культур, варианты утилизации биоразлагаемых мульчи (BDMs) включают вывозиться на свалку, сжигание с рекуперацией энергии ^10, деградация через компостирование, или деградации в почве после обработки почвы ^11. Из них наименее трудоемкие судьба вспашки BDMs в почву, но без эффективной деградации и минерализации во несельскохозяйственных месяцев (как правило, в зимнее время), пластиковые фрагменты могут оставаться и мешать сельскохозяйственного оборудования во время обработки почвы весной и посадки, а также сохраняются в окружающей среде, где они существенно повлиять Дикая жизнь, растительная жизнь, и микрофлора ^1,2,3,10.

<p claСС = "jove_content"> Хотя многие пластмассовых изделий, в том числе сельскохозяйственных пленок мульча, иметь метку "биоразлагаемый" или "компостируемый", на практике деградации и минерализации может быть неэффективным и / или слишком неполной в почве разложения быть жизнеспособной альтернативой для утилизации этих продуктов. Например, оксо-биоразлагаемых полиэтилены достигнуто только 12,4% минерализации после одного года выветривания и трех последующих месяцев в 58 ° C компост, и менее половины этой суммы минерализации произошло, когда температура компоста составляла 25 ° C ^12. В зимнее время температура почвы в большинстве мест была бы ниже, чем любой из этих температур, предположительно в результате чего еще более низкую активность микробных а следовательно, меньше минерализации. Кроме того, чтобы замедлить темпы деградации, неправильного использования термина «биологически» привела к недоверию этих продуктов потребителями ^13,14, в том числе в сельском хозяйстве. Биодеградации является превращениеполимеров в диоксид углерода (и / или метан) и воды ¹⁴ на природные микроорганизмы ^4. Таким образом, биодеградации должна быть измерена химически; физической ассоциации микроорганизмов с подложкой не подразумевает микробной деградации этого материала.

В рамках усилий, чтобы изучить устойчивого использования BDMs в сельском хозяйстве, это исследование было сфокусировано на выявлении микроорганизмов рода сельскохозяйственных почв, которые колонизировали и ухудшить имеющиеся в продаже BDMs. Стандартные методы испытаний были опубликованы для химически измерения распад биоразлагаемых пластиков абиотических и биологических средств ^15,16,17. Однако эти способы не решают деградации пластмассы отдельных видов микроорганизмов, или создание способов их изоляции. Методология здесь больше напоминает стандартные методы, предназначенный для оценки пластмасс на устойчивость к разложению под воздействием бактерий после посева образцов с грибковыми спорами18,19.

Когда составы пластмасс известны и источника сырья доступно, порошкообразный пластик может быть приостановлено в агар на основе информации и деградации путем визуального зон очистки ^13. Этот метод был использован ранее для выявления микроорганизмов, которые разрушают полимеры, такие как полиуретан ^20, поли (бутилен сукцинат-со-адипат) ²¹ и поли (молочная кислота) ^22. Аналогичный способ включает суспендирующий чистый порошкообразный пластик в жидкой среде, где пластик единственного источника углерода ^20,23. Хотя эти методы имеют то преимущество, определенной системе, они плохо имитировать на месте деградации BDMs. Во-первых, площадь поверхности распределяется по-разному из-за BDMs не диспергированного в небольших частиц по почвенной матрице, а, скорее, продается и используется в качестве пленок. Во-вторых, химический состав BDMs отличается от чистых полимеров. BDMs обычно содержат добавки, такие какнаполнители, пластификаторы и красители, и эти добавки могут влиять на рост микроорганизмов и, таким образом, скорость минерализации. По этой причине, а также потому, что состав определенных коммерческих фильмов в этом исследовании были собственные, полиэтиленовая пленка в своей области-готовом виде был использован для изоляции грибков и бактерий. Для простоты ниже методы описаны только грибов, с модификациями отметить, где это уместно для бактериальной изоляции.

В недавнем исследовании ^24, три коммерчески доступных BDMs и одного экспериментального фильма были использованы на сельскохозяйственных объектах в трех различных регионах Соединенных Штатов в течение одного вегетационного периода, а затем помещают в сетку (250 микрон) сумки и похоронен в течение одной зимы в почве на тех же участках. Отверстия 250 микрон позволяет гифы гриба проникнуть исключая корни и наиболее фауны почв, а также минимизация почвы посягательства ^25,26. Нейлон материалы предотвращения деградации сумку в почве. После раскопок, Fungal изолятов были извлечены из БДМ части и оценивали роста на минимальной среде без источника углерода, за исключением агара и 5 см х 5 см поверхность дезинфицируют квадрат новый, не используется пленка БДМ, который был предварительно дезинфицируют. Большинство пластмасс используются в качестве фильмов не могут обрабатываться в автоклаве без потери целостности, так что УФ-свет был использован, чтобы убить клетки микроорганизмов, проживающих на пластмассы. ISO ¹⁹ 846 рекомендует поверхностно-обеззараживанию в 70% этаноле и последующей сушки, но если с помощью этого метода, необходимо обеспечить, чтобы ни один из компонентов или добавку фильма не оказывает отрицательное влияние этанола. С BDMs предположительно производятся выдерживать солнечного света, УФ был выбран в качестве метода очистки.

Изоляты, которые росли на BDM части лучше, чем на минимальной среде одни были отобраны для дальнейшего изучения. Агар, полисахаридов, полученных морских водорослей, используется, чтобы укрепить микробной среды, потому что, как правило, не используются метаболически по сельскохозяйственно и медицински нев состоянии микроорганизмов, однако, агар-гидролиза ферментами были выделены из морской бактерии ²⁷ и агар-гидролиз бактерии также были выделены из почвы ^28. БДМ полимеров и агар как ожидается, будет редким субстратов для ферментов, выделяемых почве грибков, которые не развивались в средах, содержащих эти полимеры в качестве потенциальных источников питательных веществ, но обе подложки присутствуют в пластине биологического анализа, описанные здесь (Этап 7). Грибы, которые используют BDMs но не агара в качестве источника углерода могут быть дифференцированы от грибков, которые используют агар только путем сравнения роста на отвержденную агаром среду, содержащую я) без добавления источника углерода, за исключением агара (отрицательный контроль), II) БДМ пленки (экспериментальный) и III), глюкоза (положительный контроль). Рост всех изолятов, как ожидается, на минимальной среде и глюкозы; грибов не возникающие при содержащей глюкозу пластины могут быть способны к росту на минимальной среде конкретного используемого в эксперименте. Potentiдр. BDM деструкторов должны расти на агаре затвердевшего минимальной среды + BDM фильм лучше, чем они растут на агар-затвердевших минимальной среде в одиночку. Грибы, растущие на минимальной средой являются агар-деструкторов или олиготрофов, а также ожидается, вырастет на агар, связанные с BDM фильмов в биопроб пластин, но не на сами фильмы (если они по счастливой случайности также ухудшают BDM полимеры).

Чтобы исключить возможность увидеть рост микроорганизмов за счет использования агара, а не компании BDMs, мы следовали наши первоначальные анализ для BDM колонизации агара с биопроб в определенных бульоном (шаг 9). БДМ части представлена ​​единственным известным источником углерода в биологической труб.

После первоначального скрининга, и на возрождение глицерине из изолятов, некоторые сформированный скудный, но видимый мицелия в жидком определенной среде, не содержащей известного источника углерода. Эти результаты показали, что некоторые из приобретенной изолятов были oligotrophs – организмы, которые растут на очистку очень небольших количеств углерода, азота и других питательных веществ, растворенных либо в водной среде или существующие как летучих веществ в воздухе ^29,30,31. Определение видов через 18S рибосомальной ДНК-анализа поддержал эту точку зрения, так как многие из изолятов соответствует родами грибов сообщалось ранее проявлять гипотрофия ^32. Олиготрофов, которые обычно сапрофиты, требуют широкого спектра метаболических возможности для утилизации субстрата в различных средах ^30. Таким образом, не удивительно, что теми же грибами мы изолированы от BDMs (предположительно требующих необычных возможностей ферментативного) продемонстрировал олиготрофная мощностей, и смогли расти на микропримесей, таких как кожа масла от отпечатков пальцев, пыли и следов летучих веществ в воздухе. В связи с выделением олиготрофов, мы пришли к выводу, что рост на БДМ поверхность сама по себе не может быть использован, чтобы вывести БДМ пробой. Описанные здесь способы отражают наши усилия по SCReen родной колонизаторов BDM от сельскохозяйственных почв для добросовестных пробоя BDM.

Protocol

Эта процедура требует, по крайней мере, нескольких месяцев для инкубации BDM фильмов в почве, и еще несколько месяцев для последовательного биопробы как на агар пластины и в агар-бесплатно, определенного химического бульона для оценки колонизации и деградации. Индивидуальные методы пер…

Representative Results

В недавнем исследовании 24, четыре повторяет каждый из трех имеющихся в продаже BDMs надписью "биоразлагаемый", а также экспериментальное кино и обычные пластиковые контроль, были размещены в минувшие почвы в качестве мульчи для томатного производства в весной 2010 года в Маунт-?…

Discussion

Процедура, описанная в этом документе представляет первый проход техники выделения потенциальных деструкторов BDM из почвы, и был успешно использован для выделения грибов из BDMs похоронен в почве в течение семи месяцев. Грибы росли при reinoculated на свежий материал БДМ того же типа, что указ?…

Materials

Reagent Name	Company	Catalog Number	Comments
Potato Dextrose Agar	Becton Dickinson	8X05491
Agar	Fisher	BP 1423-2
Chloramphenicol	Acros Organics	200-287-4
Glutaraldehyde	Electon Microscopy Sciences	16216-10	Toxic
Molecular sieve	Fisher	M-8892
Ethanol	Pharmco-Aaper	E200
Contrex	Decon Labs, Inc.	5204
Parafilm M	Pechiney Plastic Packaging	S37440
Mineral salts for buffers and media	Fisher	Various	Various vendors sell these reagents