Summary
In dit artikel beschrijven we een geoptimaliseerd voor de extractie en analyse van prostaglandines en andere eicosanoïden uit
Abstract
Caenorhabditis elegans is in opkomst als een krachtig diermodel om de biologie van lipiden 1-9 te bestuderen. Prostaglandinen zijn een belangrijke klasse van eicosanoïden die lipide signalen afgeleid van meervoudig onverzadigde vetzuren (PUFA) 10-14 zijn. Deze signaalmoleculen zijn moeilijk te bestuderen vanwege hun lage overvloed en reactief karakter. Kenmerkend prostaglandinen een cyclopentaanring structuur binnen de vetzuur backbone. In zoogdieren kan prostaglandines worden gevormd door cyclooxygenase enzym-afhankelijke en-onafhankelijke routes 10,15. C. elegans synthetiseert een breed scala van prostaglandines onafhankelijk van cyclooxygenases 6,16,17. Een grote klasse van F-serie prostaglandines is geïdentificeerd, maar de studie van eicosanoïden is in een vroeg stadium met veel ruimte voor nieuwe ontdekkingen. Hier beschrijven we een werkwijze voor de extractie en analyse van prostaglandinen en andere eicosanoïden. Geladen lipides worden uit massa worm kweken met een vloeistof-vloeistof extractie techniek en geanalyseerd door vloeistofchromatografie gekoppeld met electrospray ionisatie tandem massaspectrometrie (LC-ESI-MS/MS). De opname van gedeutereerde analogen van prostaglandinen, zoals PGF 2 α-d 4 als interne standaard wordt aanbevolen voor kwantitatieve analyse. Multiple Reaction Monitoring of MRM kunnen worden gebruikt te kwantificeren en te vergelijken specifieke typen prostaglandine tussen wild-type en mutante dieren. Botsingsgeïnduceerde afbraak of MS / MS kan worden gebruikt om informatie te verkrijgen over belangrijke structurele kenmerken. Vloeistofchromatografie massaspectrometrie (LC-MS) onderzoek scans van een geselecteerd massabereik, zoals m / z 315-360 kan worden gebruikt om globale veranderingen in prostaglandine niveau te beoordelen. We geven voorbeelden van alle drie analyses. Deze methoden zullen onderzoekers te voorzien van een toolset voor het ontdekken van nieuwe eicosanoïden en de afbakening van hun metabole routes.
Introduction
Prostaglandines (PG's) zijn een belangrijke klasse van lipiden hormonen die zijn uitgebreid onderzocht en betrokken is bij de voortplanting, immuniteit, en ontwikkeling in een breed scala van organismen 12-14. PG zijn ideaal voor uitgebreide systemenbiologie gevolgd omdat ze een serieschakeling van lipiden afkomstig uit een gemeenschappelijke precursor (s). De nematode C. elegans is een van de meest gebruikte modelorganismen om fundamentele vragen in de genetica en systeembiologie pakken.
We hebben aangetoond dat C. elegans synthetiseert F-serie PG's die gids beweeglijk sperma aan eicellen 3,6,16. F-series PG afgeleid van 20-carbon PUFA met drie, vier en vijf dubbele bindingen, omvattende de F1, F2 en F3 respectievelijk de klasse geïdentificeerd 3,16. De PG's worden onafhankelijk van cyclooxygenase enzymen gesynthetiseerd, maar PGF 1α en PGF 2α stereoisomeren steeds gevergoede. Kwalitatieve en kwantitatieve analyses van C. elegans PG, LC-MS/MS is een krachtige en gevoelige analytische techniek. Voordat deze analyse is het belangrijk om een optimale extractie method Doordat de performance van het analyseproces sterk afhankelijk van de kwaliteit extract. Vloeistofchromatografie en massaspectrometrie kan alleen voorzien massa-verhouding (m / z) belasten, en wenselijk piekvorm en de retentietijd van de PG moederion. Metabool profiel van PG's in C. elegans is een uitdagende taak die verschillende MS overnamestrategieën.
LC-MS volledige scan of survey scanning (Q1 scanning) heeft het voordeel dat de meeste ioniseerbaar PG een massaspectrometrische respons te genereren. Terwijl de enquête scan geeft nuttige informatie over de totale profilering van PG's met betrekking tot wild-type en mutant C. elegans, detectie van kleine PGs wordt gecompromitteerd vanwege een lage gevoeligheid. Toch voorminder, kan LC-MS onderzoek scanning een algemeen beeld geven van PG en is bijzonder nuttig voor het analyseren mutanten voorspeld metabolisme van een grote PG bevolking treffen.
In metaboliet identificatie, wordt LC-MS/MS analyse van chemisch gesynthetiseerde PG normen eerst uitgevoerd om hun product ion spectra te verkrijgen als referentie verbindingen. Deze spectra kunnen worden vergeleken met het spectrum van een onbekende metaboliet. Monitormodus Multiple reactie (MRM) wordt gebruikt voor verhoogde gevoeligheid en specificiteit. Een MRM experiment wordt bereikt door het specificeren van de ouder-ion / product ionenmassa overgang van een verbinding. Door te weten de massa en de structuur van de doelanalyten, kan men theoretisch MRM overgangen voorspeld voor vele onbekende metabolieten.
Een geoptimaliseerde LC-MS/MS methode voor het profileren van isomere PG's in C. elegans is niet gemeld. Hier beschrijven we een extractie-en geïntegreerde massaspectrometrie aanpak bestaande uit LC-MS en LC-MS / MS methoden voor het opsporen, kwantificeren en onderzoekt C. elegans PG metabolieten. Deze benadering kan worden toegepast op andere eicosanoïden.
Protocol
Het protocol zoals hieronder beschreven is verdeeld in drie secties: worm cultuur, prostaglandine extractie, en prostaglandine-analyse. Zoals gezegd kunnen meerdere punten als monsters tijdelijk bij -80 ° C of -20 ° C worden opgeslagen
1. Worm Cultuur
We raden ongeveer 6 g gemengde podium wormen voor uitgebreide LC-MS/MS. Dit zou voldoende materiaal te verschaffen voor het detecteren van ten minste zes afzonderlijke injecties. Voor kwantificering van bekende PG door MRM in een enkele injectie of twee, 1-2 g voldoende. Analyse van de fragmenten van gesynchroniseerde kweken uit een bepaalde fase is mogelijk. Maximaal 4 verschillende stammen tegelijkertijd worden gekweekt. Bijvoorbeeld, een wildtype controle en drie mutante stammen.
- Bereid 65 X-large (16 cm) NGM platen en geconcentreerde bacteriën voor extra voeding. Gebruik NA22 bacteriën te zaaien. Om geconcentreerde bacteriën zorgen voor extra voeding, grow minstens vier liter NA22 in LB medium voor 16-24 uur. Spin down, verwijder het supernatant en resuspendeer bacteriën in 100 ml M9 buffer. 200 tot 400 ml van de geconcentreerde bacteriële oplossing kan nodig zijn voor elke worm stam. Bewaren bij 4 ° C.
- Start worm culturen op 5 X-grote platen. Groeien wormen voor ongeveer 3 tot 4 generaties totdat platen zijn vol zwangere volwassenen. Geconcentreerde bacteriën moet worden toegevoegd aan platen aan honger te voorkomen, indien nodig (~ 1 ml / plaat en laat volledig drogen voordat u het deksel).
- Wassen gravid hermafrodieten uit platen met M9 buffer en het verzamelen van de wormen in een ml conische polypropyleenbuis 50.
- Laat gravid hermafrodieten om zich te vestigen op de bodem (meestal ongeveer 3-5 minuten). Verwijder supernatant, waaronder bacteriën, eieren en larvale stadium wormen. Opnieuw in suspensie in 15 ml M9 buffer en meng.
- De overdracht 200 ul worm schorsing aan elk van de 60 geplaatste NGM platen. Dispergeren wormen over de borden. Houd worm oplossing gemengdgoed totdat alle platen geënt zodat deze ongeveer gelijk aantal wormen ontvangen.
- Aanvullen met geconcentreerde bacteriën als nodig (~ 1 ml/plate/12 tot 24 uur periode) aan honger te voorkomen. Laat platen aan de lucht drogen voordat u deksels. Groei wormen 2-4 generaties afhankelijk van de oorspronkelijke aantal geplaatste wormen of tot platen vol zwangere volwassenen.
- Oogst worm platen een stam tegelijk. Wassen wormen uit de platen met M9 buffer en in een 50 ml polypropyleen buizen (bv. 6 tubes). Gebruik M9 buffer om een plaat te wassen, vervolgens over de worm gevulde buffer naar de volgende plaat. Na het wassen van een nummer (bijvoorbeeld. 10 e) van platen, de overdracht van de worm gevulde buffer om de 50 ml buis. De buis wordt tot de top met M9 buffer. Herhaal de was voor de rest van de platen.
- Als de zwangere volwassenen naar de bodem in 5-6 min., de bovenstaande vloeistof (~ 35 ml) en consolideren in een of twee buizen. Vul de buizen om met fr 50 mlesh M9 buffer, laat staan voor 3-5 minuten, en verwijder supernatant verlaten zwangere volwassenen. 3 herhalen of totdat de supernatant transparant.
- Met een grote diameter Pasteur pipet zoveel wormen mogelijk twee 15 ml polypropyleen conische buizen. Spin down op 1000 RCF (~ 3500 rpm in CentraSL2) gedurende 5 min in een klinische centrifuge. Verwijder supernatant en herhaal totdat alle wormen worden overgedragen en pellets in dezelfde buis. Verwijder zoveel mogelijk supernatant en bewaar wormen bij -80 ° C. Herhaal dit voor alle stammen.
2. Prostaglandine Extraction
De reagentia die nodig zijn voor de extractie worden hieronder weergegeven. De methode is aangepast van die van Golovko en Murphy 17 en omvat acetonextractie gevolgd door vloeistof-vloeistof zuivering, die LC-MS/MS gevoeligheid verhoogt. Een Bullet Blender homogenisator 5 wordt gebruikt in de werkwijze, maar soortgelijke resultaten kunnen worden verkregen met een Dounce homogenisator. Gebutyleerde hydroxytoluene (BHT) en verdamping onder stikstof (N2) gas gebruikt om oxidatie te voorkomen. Alle glaswerk moet worden siliconized (Sigmacote) naar lipidebindende verminderen. Extractie met organische oplosmiddelen moet worden uitgevoerd in een chemische kap.
- Weeg een ml polypropyleen conische buis 50. Breng circa 6,0 g bevroren wormen uit de 15 ml conische buis bewaard bij -80 ° C door te snijden door de buis met een heet scheermesje in de buurt van de 6,5 ml markering. Een methanol-gereinigde spatel kan worden gebruikt om de bevroren pellet worm verwijderen van de bodem van de buis. Door doorsnijden van de pellet aan het onderste gedeelte, minder dichte larven wormen en resterende bacteriën ophalen uit de top van de pellet wordt achtergelaten.
- Breng de bevroren wormen de vooraf gewogen 50 ml conische buis. Indien meerdere monsters worden verwerkt, maken gebruik van dezelfde hoeveelheid (6,0 g) van weefsel voor vergelijkende studies. Als de wormen dooi tot een pasta, wormen toevoegen of verwijderen met de spatel om de gewenste massa te verkrijgen. Optioneel: add 1,00 ng PGF 2α-d4 norm als een interne controle voor de extractie-efficiëntie.
- Voeg 12 ml ijskoude 02:01 aceton / zoutoplossing met 0.005% BHT om de worm schorsing en meng goed door vortexen. Verdeel 1,5 ml van de worm suspensie aan elk van twaalf 5 ml zichzelf staande kunststof buizen voor gebruik in de Bullet Blender.
- Voeg 0,7-0,8 ml van 0,5 mm diameter Ceria gestabiliseerd zirkoniumoxide kralen aan elke buis 5 ml. Sluit doppen stevig vast en laad de 12 buizen in de Bullet Blender 5 homogenisator. Voer de blender gedurende 3 min op snelheid 8-9 en plaats de buizen op ijs. Zorg ervoor dat de doppen zeer goed sluiten of de inhoud kan worden gemorst. Controleer 10 ul van homogenaat van de ene buis op een dia met behulp van een stereoscoop. Er moet heel weinig intacte wormen overgebleven. Herhaal dezelfde snelheid nog een minuut, indien nodig.
- De homogenaten gelijkmatig over te brengen naar vier 10 ml conische glazen buizen met behulp van een "pasteurpipet 9. Vermijd het overbrengen van kralen. Was de kralen uit drie buizen Sequentially met 1 ml 1:2 aceton / zoutoplossing met BHT. Herhaal dit voor de andere buizen totdat alle korrels worden gewassen. Draagt de resterende oplossing (~ 4 ml) tot de 10 ml glazen buizen en leg ze op ijs.
- Centrifugeer de 10 ml glazen buizen bij 4 C in een klinische centrifuge bij ongeveer 1000 g gedurende 10 min °. Breng de bovenstaande van elke buis een schone glazen 10 ml conische buis.
- In een chemische kap, een gelijk volume hexaan aan elke 10 ml glazen buis. Bijvoorbeeld, voeg 3,5 ml hexaan en 3,5 ml aceton / zoutoplossing. Vortex bij maximale snelheid 30 sec.
- Centrifugeer de 10 ml glazen buizen bij 4 C in een klinische centrifuge bij ongeveer 1000 g gedurende 10 min °. Gooi de bovenste fase die hexaan en neutraal geladen lipiden.
- Zuur de onderste fase tot pH 3,5 met 2 M mierenzuur (ongeveer 100-150 ul). Test pH met behulp van pH-strips.
- Voeg een gelijk volume chloroform aan elke buis. Vortex bij maximale snelheid gedurende 30 seconden en centrifugeer de buizen bij 4 ° C ina klinische centrifuge bij ongeveer 1000 g gedurende 10 minuten.
- Verwijder de bovenste waterige fase. Steek een pipet tip via alle resterende melkachtige interfase naar de lagere chloroform fase, het vermijden van de interfase. Verzamel de onderste fase van elk van de 4 buizen naar een schone 15 ml conische glazen buis. Incubeer bij -20 ° C gedurende ten minste 24 uur. Op dit punt, kan het extract worden bij -20 ° C gedurende twee weken opgeslagen.
- Neem het extract uit de vriezer en gooi de resterende melkachtige waterige toplaag, indien aanwezig. Breng de chloroformfase een label teflon-bekleed ½-Dram glazen flesje met een nieuwe Pasteur pipet. In een chemische kap, verdampen de chloroform oplosbare fractie tot droog onder een zachte stroom van N 2 gas. Het gedroogde extract kan bij -20 ° C gedurende maximaal 2 weken bewaard. Een algemeen schema voor PG extractie en analyse wordt getoond in figuur 1.
3. Prostaglandine Analyse
- Bereid voorraadoplossingen van individuele referentie prostaglandinen, zoals PGF 2α of PGF 2 α-d4 (1 ug / ml) in methanol en verdun met methanol: water (08:02 v / v) om een werkoplossing te verkrijgen. Bereid een reeks verdunningen (100, 10, 1, 0,1, 0,01 ng / ml) tot een standaardcurve te genereren.
- Voeg 200 ul methanol: water (08:02 v / v) op de gedroogde C. elegans vetextract (s) en meng. Als er minder dan 6 gram worm weefsel werd geëxtraheerd, moet de droge stof worden gesuspendeerd in minder volume methanol: water oplossing.
- Bereid de mobiele fase, bestaande uit 0,1% mierenzuur in water [A] en acetonitril dat 0,1% mierenzuur [B].
- Stel de autosampler bij 4 ° C en plaats het monster flacons in een 70-count 1,5 ml flacon rack.
- Evenwicht van de Synergy hydro-RP C18 kolom met 0,1% mierenzuur bij een debiet van 0,2 ml / min gedurende 5 minuten.
- Breng het monster (20-50 pi) in de kolom. Voer gradiënteluering starting met 10% B en gaan tot 80% B 0-11 min, 80-100% B 11-14 min, en keert terug naar 10% B in 16 min.. De totale looptijd is 20 minuten. De retentietijden van 13 authentieke standaarden worden in tabel 1 voor referentie 3.
- Steek de kolom effluent in de massa spectrometer met een ESI-interface die in de negatieve ion modus. Stikstof wordt gebruikt als vernevelaar en gordijnen gas (CUR = 10). De botsing gas, botsingsenergie, en de temperatuur worden ingesteld op 10, -35 eV en 600 ° C, respectievelijk. Ontclustering potentiële (DP), botsingsenergie (CE) en mobiele exitpotentieel (CXP) worden ingesteld op -90, -35 en -10, respectievelijk.
- Voor onderzoek scans (Q1 scans), gebruikt negatieve ion modus het massabereik van m / z 315-360 voor twee PG (figuur 2). Het bereik kan worden aangepast, afhankelijk van de massa van de verbinding (en) plaats. Uittreksel ionen van de totale ionenstroom (TIC) van LC-MS ion chromatogrammen en bepalen of de winningted ionen overeen met gedeprotoneerde of adduct ionen, of fragment-ionen.
- Voor MRM experimenten overgang massa m / z 355/311 wordt gebruikt om het F1 klasse detecteren, m / z 353/193 wordt gebruikt voor de klasse F2 en m / z 351/193 of 351/191 wordt gebruikt voor de klasse F3 (Figuur 3). MRM wordt ook gebruikt om de interne standaard (bijvoorbeeld m / z 357/197 voor PGF 2α-d4) detecteren en de standaardkromme te genereren. Zie Murphy et al.. Voor aanvullende informatie over PG massale overgangen 18.
- Voor MS / MS-experimenten, gebruik m / z 355 voor F1 klasse, m / z 353for F2 klasse, en m / z 351for F3 klasse PG's. C. elegans MS / MS gegevens voor F-serie PG is in figuur 4 en tabel 2 3,16. MS / MS-gegevens voor zoogdieren eicosanoïden is beschikbaar op www.lipidmaps.org .
- Verwerk de analytische gegevens met behulp Analyst-software (versie 1.4.2, Applied Biosystems).
Representative Results
Voorbereiding van het monster werd uitgevoerd door vloeistof-vloeistof extractie aangepast van Golovko en Murphy 17. Het leverde uitstekend herstel van de interne standaard (PGF 2α-d4). De algemene regeling voor de PG extractie uit C. elegans wordt getoond in figuur 1. Chromatografische omstandigheden werden geoptimaliseerd om basislijnscheiding van> 30 eicosanoïde standaarden (Tabel 1 toont 13-normen) bieden. Een Hydro-Rp kolom (250 x 2,0 mm ID) met water en acetonitril dat 0,1% mierenzuur ontvangen de beste scheiding en gevoeligheid. Enquête scans van wild-type en vet-3 mutant extracten weergegeven in figuur 2 document globaal niveau van ionen binnen de massa bereik van 315-360 atomaire massa-eenheden. Vet-3 (WA22) mutanten missen de meeste 20-koolstof-PUFA's. Een F3-klasse PG is gemarkeerd. In figuur 3, MRM analyses van een wildtype extract tonen verschillende PG isomeren van de F1 (figuur 3A ng>), F2 (figuur 3B) en F3 (Figuren 3C en 3D) klassen. De F3 klasse kan worden gedetecteerd met een van twee massa overgangen, m / z 351/193 of m / z 351/191. CePGF2 hoofdzakelijk uit de PGF 2α enantiomeer. CePGF1 waarschijnlijk PGF 1α of zijn enantiomeer. Figuur 4 toont de botsing-geïnduceerde ontleding van CePGF2 (RT = 11,8) in vergelijking met de PGF2 α standaard (RT = 11,8). Kleine verschillen in de product-ionen zijn waarschijnlijk te wijten aan lage CePGF2 overvloed en co-eluerende verbindingen in het extract.
Figuur 1. Schematisch diagram van C. elegans PG extractie en LC-MS-analyses. Merk op dat aceton / zoutoplossing en chloroform beide 0.005% BHT aan lipide oxidatie te minimaliseren. Verwijzen naar de tekst voor meer informatie.https://www.jove.com/files/ftp_upload/50447/50447fig1large.jpg "target =" _blank "> Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Enquête scans van m / z 315-360 van wild-type en vet-3 (WA22) mutant extracten. Vloeistofchromatografie retentietijd (RT) wordt getoond in panel [A]. Onttrokken ionen bij RT = 11.3 worden getoond voor wild-type [B] en vet-3 (WA22) [C] extracten. Een F3-klasse PG met massa m / z 351 is gemarkeerd. Cps, tellingen / sec; amu, atomaire massa-eenheid.
Vijgure 3. MRM analyses van wild-type extracten. F1 klasse PG's worden gedetecteerd met massale overgang m / z 355/311 [A]. Merk op dat meerdere hydrofobe verbindingen (RT> 14 min), die waarschijnlijk niet in PG's zijn ook gedetecteerd met deze overgang. F2 klasse PG's worden gedetecteerd met massale overgang m / z 353/193 [B]. F3 klasse PG's worden gedetecteerd met ofwel massa transitie m / z 351/193 [C] of m / z 351/191 [D]. Merk op dat de extracten bevatten meerdere PG-isomeren van elke klasse. Nummers corresponderen met PG getoond in Tabel 2. De concentratie van CePGF2 is 1,8 ng / ml. RT, retentietijd; cps, tellingen / sec.
Figuur 4. Botsingsgeïnduceerde ontleding van chemisch synthesized PGF 2α en CePGF2. Arrows in panel [A] duiden product of fragmentatie ionen gedeeld tussen PGF 2α en CePGF2 (RT = 11.8). Het product ionen bij m / z 309 en m / z 193, zijn van aangegeven splitsingsplaatsen (gemarkeerd a en b), overeen met de structuren die zijn getoond en zijn kenmerkend F-series PG [B]. Cps, tellingen / sec. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
| Standaard | RT (min) | [MH] - m / z | Belangrijkste product ionen in MS / MS | ||||
| 20-hydroxy-PGE2 | 9.43 | 367 | 349, 331, 287, 234, 189, 129, 109 | PGF 3 - | 11.26 | 351 | 333, 307, 289, 271, 245, 219, 209, 193, 191, 171, 165, 111 |
| Tromboxaan B 2 | 11.66 | 369 | 289, 191, 177, 169, 151 | ||||
| PGF2 - | 11.80 | 353 | 335, 309, 291, 273, 263, 247, 235, 209, 193, 171, 165, 111 | ||||
| PGF 1 - | 11.79 | 355 | 337, 319311, 301, 293, 275, 265, 237, 211, 195 | ||||
| Lipoxine B 4 | 12.38 | 351 | 201, 191189, 165, 155, 115, 107, 71, 59 | ||||
| PGD2 | 12.56 | 351 | 315, 271203, 189 | ||||
| 5 (S), 6 (R) - Lipoxin A4 | 12.83 | 351 | 235, 217, 189, 144, 135, 115, 99, 59 | ||||
| PGA 2 | 14.02 | 333 | 315, 297, 271, 235, 191, 189, 175, 163, 137, 113, 109 | ||||
| Δ12-PGJ 2 | 14.20 | 333 | 271, 189, 123 | ||||
| Leukotrieen B4 | 14.73 | 335 | 181, 109, 93, 71, 69, 59, 57 | ||||
| 15d-Δ 12,14-PGJ 2 | 16.80 | 315 | 297, 271, 217, 203, 158 | ||||
| 5 (S)-HPETE | 17.88 | 335 | 97, 83, 81, 57 |
Tabel 1. Retentietijden en belangrijkste product ionen van 13 eicosanoïde normen uit de LC-MS/MS methode 3. Meer dan 30 standaarden werden gebruikt om de LC-MS/MS programma. De chromatografische retentie tijden (RT's) verschillen, zelfs onder zeer vergelijkbaar PG's. Een uitzondering is PGF 1α en PGF 2α. Toch hebben deze PG's zijn distinguished door hun ouder ion massa ([MH] - m / z) en botsingsgeïnduceerde ontleding spectra (MS / MS).
| Prostaglandine klasse | No in figuur 3 | [MH] - m / z | Belangrijkste product ionen in MS / MS |
| F1 (CePGF1) | 1 | 355 | 319, 301, 311, 293, 275, 265, 237, 223, 211, 195, 157 |
| F1 | 2 | 355 | 311, 301, 293, 275, 265, 211, 195, 167, 157 |
| F2 (CePGF2) | 3 | 353 | 309, 291, 273, 263, 247, 209, 193, 171, 165, 127 |
| F2 | 4 | 353 | 309, 291, 273, 263, 255, 247, 219, 209, 193, 171, 113 |
| F3 | 5 | 351 | 315, 307, 289, 275, 249, 205, 193, 191, 167, 153, 139 |
| F3 | 6 | 351 | 333, 289, 271, 261, 245, 223, 193, 191, 163 |
Tabel 2. Botsingsgeïnduceerde ontledingsprodukt ionen voor verschillende grote C. elegans F1, F2 en F3 PG getoond in figuur 3. MS / MS of andere minder overvloedig isomeren worden niet weergegeven. Deze gegevens zijn afkomstig uit meerdere analyses en niet alle product-ionen kan zichtbaar zijn in een bepaalde run. Gezien de complexiteit van de extracten, sommige minder overvloedig product ionen afkomstig zijn van een andere ouder ion met gelijke retentietijd of het resultaat van interferentie. Peak 2 is waarschijnlijk een stereo-isomeer van CePGF1 en peak 4 waarschijnlijk een stereo-isomeer van CePGF2. Zie Edmonds, et al.. (2010) voor aanvullende gegevens 3.
Discussion
We beschrijven een procedure voor eicosanoid extractie en analyse, gericht op de F-serie PG's. Er zijn verschillende delen van de procedure die kan problematisch zijn. Ten eerste, is het essentieel dat de worm culturen niet verhongeren, zoals honger kan PG metabolisme te veranderen. Voor aanvullende voeding, worden NA22 bacteriën in plaats van de meer algemeen gebruikte OP50 bacteriën aanbevolen omdat NA22 bereikt hogere dichtheid. De NA22 stam mist antibioticaresistentie en is vatbaar voor besmetting. Ten tweede, wormen synthetiseren individuele PG isomeren in geringe hoeveelheden in verhouding tot zoogdierweefsels. Dit kan deels te wijten aan redundantie onder de talrijke isomeren. Wij adviseren ongeveer 6 g weefsel voor een uitgebreide analyse en sterkere signalen. Minder weefsel (1-2 g) kan worden gebruikt als de droge stof wordt opnieuw gesuspendeerd in minder methanol: water oplossing PG concentratie verhogen. Echter, slechts een tot twee injecties worden uitgevoerd. De detectielimiet van LC-MS/MS ons systeem is ongeveer 10 pgPGF 2α / ml. Een ml gemengde dicht op elkaar gepakte stadium wormen (ongeveer 1 g) levert ongeveer 25-50 pg van CePGF2. Meer gevoelige massaspectrometrie systemen kunnen de hoeveelheid worm weefsel nodig voor de analyse te beperken. Ten derde kunnen verschillen in extractie-efficiëntie onder PG monsters variabele resultaten opleveren. Wij hebben gevonden dat extractie efficiëntie vergelijkbaar wanneer weefsels worden geëxtraheerd in parallel. Om de efficiëntie te bepalen, voeg 1,0 ng PGF 2α-d 4 aan de homogenisatiestap als een interne controle. MRM overgang met massa m / z 357/197 wordt gebruikt om PGF 2α-d4 concentratie ten opzichte van een 1 ng / ml standaardoplossing meten. De hoeveelheid PGF 2α-d 4 verloren tijdens extractie wordt berekend.
De parameters chromatografie en massa overgangen we opnemen kan worden aangepast aan andere PG en eicosanoïden detecteren. Ondanks aanzienlijke inspanningen, hebben wij niet in staat om D-serie of E-ser identificerenies PGS in de extracten 17. Bovendien hebben we ontdekt 8-iso PGF 2α en 8-iso PGE2 die kenmerkend vrije radicalen geïnitieerde peroxidatie, die een selectieve mengsel van stereoisomeren PG 19 genereert. Of wormen synthetiseren andere PG is niet bekend. Endocannabinoids en diverse epoxy en hydroxy metabolieten van arachidonzuur en eicosapentaeenzuur zuren gevonden in C. elegans haalt 5,7,20,21. Wij raden het gebruik van zowel MRM en MS / MS in vergelijking met authentieke standaarden voor kwantificering en identificatie, respectievelijk. Van nieuwe eicosanoïden, moet deze analyses worden aangevuld met een studie van vet mutanten die deficiënt zijn in PUFA synthetiserende enzymen 22, alsmede een functionele assay, indien mogelijk. Een waarschuwing voor de analyse van vetten mutanten is dat kleine hoeveelheden PUFA's aanwezig in wormen zijn voldoende voor PG-synthese. Bijvoorbeeld, vet-2 (wa17) mutanteneen kleine hoeveelheid D12 desaturaseactiviteit (~ 5% van de wild type 22) en deze mutanten produceren nog PG 6. vet-3 (WA22) en vet-4 (WA14) mutanten niet PG afgeleid van arachidonzuur en eicosapentaeenzuur zuren 16 synthetiseren . We hebben ook ontdekt dat vet mutanten compenseren voor het verlies van PUFA klassen door up-reguleren PG synthese van de resterende lessen. Bijvoorbeeld, vet-3 (WA22) mutanten niet aan de meeste PGs afgeleid van 20-koolstof PUFA synthetiseren. In plaats daarvan, ze lijken te up-reguleren roman PGs afgeleid van 18-koolstof PUFA 16. Tot op heden hebben we niet geïdentificeerd een C. elegans stam die volledig deficiënt is in PG-synthese. Het is mogelijk dat PG essentieel zijn voor groei of ontwikkeling.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Wij danken de UAB Gerichte Metabolomics en Proteomics Laboratorium, dat is mede ondersteund door de UAB Skin Disease Research Center (P30 AR050948 naar C. Elmets), de UAB-UCSD O'Brien Acute Kidney Injury Center (P30 DK079337 naar A. Agarwal ) en de UAB Lung Health Center (R01 HL114439, R01 HL110950 tot JE Blalock). Steun voor de massaspectrometer was van een NCRR Shared Bezetting subsidie (S10 RR19261 naar S. Barnes). We danken ook Ray Moore voor technische ondersteuning. C. elegans stammen werden verstrekt door de Caenorhabditis Genetics Center, dat wordt gefinancierd door de NIH. Dit werk werd ondersteund door NIH (R01GM085105 naar MAM, waaronder een ARRA administratief supplement).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||
| REAGENTS | |||||||||||||||||
| X-large (16 cm) plates | Fisher Scientific | 0875714 | |||||||||||||||
| E. coli strain NA22 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | NA22 | http://www.cgc.cbs.umn.edu | ||||||||||||||
| Acetone, 399.5% | Fisher Scientific | A928-4 | |||||||||||||||
| Butylated Hydroxytoluene | MP Biomedicals | 101162 | |||||||||||||||
| Hexane, HPLC grade | Fisher Scientific | H302-1 | |||||||||||||||
| Formic acid, 399% | Acros | AC27048-0010 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
| Chloroform, HPLC grade | Acros | AC26832-0010 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
| PGF2α-d4 | Cayman Chemicals | 316010 | Cayman has a wide array of standards available for purchase | ||||||||||||||
| Sterile screw cap self-standing 5 ml tube | Fisher Scientific | 14-222-651 | For use with Bullet Blender | ||||||||||||||
| 0.5 mm zirconium oxide beads | Next >>> Advance | ZrOB05 | |||||||||||||||
| 10 ml glass conical heavy-duty graduated centrifuge tubes | Kimble Kimax | 45200-10 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
| 15 ml glass conical tubes | Corning Pyrex | 8082-15 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
| Sigmacote (Siliconizing reagent) | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | |||||||||||||||
| Teflon lined capped 1/2 Dram glass vial | Fisher Scientific | V1235C-TFE | |||||||||||||||
| EQUIPMENT | |||||||||||||||||
| CentraSL2 Clinical Centrifuge | Thomas Scientific | 2517N92-TS | |||||||||||||||
| Bullet Blender 5 blue homogenizer | Next >>> Advance | BBY5MB | A 40 ml Dounce homogenizer can be used as an alternative | ||||||||||||||
| Synergi 4 μm Hydro-RP 80 Å LC Column 250 x 2.0 mm | Phenomenenex | 00G-4375-B0 | HPLC Column | ||||||||||||||
| SecurityGuard Cartridges AQ C18 4 x 2.0 mm | Phenomenenex | AJ0-7510 | |||||||||||||||
| SecurityGuard Guard Cartridges Kit | Phenomenenex | KJ0-4282 | |||||||||||||||
| Shimadzu Prominence HPLC with refrigerated auto sampler | Shimadzu Scientific Instruments, Inc. | Any standard HPLC system coupled to a triple quadrupole mass spectrometer should be sufficient | |||||||||||||||
| API 4000 triple quadrupole mass spectrometer | Applied Biosystems/MDS SCIEX | ||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||
References
- Watts, J. L. Fat synthesis and adiposity regulation in Caenorhabditis elegans. Trends Endocrinol. Metab. 20, 58-65 (2009).
- Marza, E., Lesa, G. M. Polyunsaturated fatty acids and neurotransmission in Caenorhabditis elegans. Biochem. Soc. Trans. 34, 77-80 (2006).
- Edmonds, J. W., et al. Insulin/FOXO signaling regulates ovarian prostaglandins critical for reproduction. Dev. Cell. 19, 858-871 (2010).
- Kniazeva, M., Shen, H., Euler, T., Wang, C., Han, M. Regulation of maternal phospholipid composition and IP(3)-dependent embryonic membrane dynamics by a specific fatty acid metabolic event in C. elegans. Genes Dev. 26 (3), 554-566 (2012).
- Kosel, M., et al. Eicosanoid formation by a cytochrome P450 isoform expressed in the pharynx of Caenorhabditis elegans. Biochem. J. 435, 689-700 (2011).
- Kubagawa, H. M., et al. Oocyte signals derived from polyunsaturated fatty acids control sperm recruitment in vivo. Nat Cell Biol. 8, 1143-1148 (2006).
- Lucanic, M., et al. N-acylethanolamine signalling mediates the effect of diet on lifespan in Caenorhabditis elegans. Nature. 473, 226-229 (2011).
- Gerisch, B., et al. A bile acid-like steroid modulates Caenorhabditis elegans lifespan through nuclear receptor signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5014-5019 (2007).
- Edison, A. S. Caenorhabditis elegans pheromones regulate multiple complex behaviors. Curr. Opin. Neurobiol. 19, 378-388 (2009).
- Funk, C. D. Prostaglandins and leukotrienes: advances in eicosanoid biology. Science. 294, 1871-1875 (2001).
- Wang, D., Dubois, R. N.
- Cha, Y. I., Solnica-Krezel, L., DuBois, R. N. Fishing for prostanoids: deciphering the developmental functions of cyclooxygenase-derived prostaglandins. Dev. Biol. 289, 263-272 (2006).
- Hata, A. N., Breyer, R. M. Pharmacology and signaling of prostaglandin receptors: multiple roles in inflammation and immune modulation. Pharmacol. Ther. 103, 147-166 (2004).
- Sugimoto, Y., Narumiya, S., Ichikawa, A. Distribution and function of prostanoid receptors: studies from knockout mice. Prog. Lipid Res. 39, 289-314 (2000).
- Basu, S. Isoprostanes: novel bioactive products of lipid peroxidation. Free Radic. Res. 38, 105-122 (2004).
- Hoang, H. D., Prasain, J. K., Dorand, D., Miller, M. A. A heterogenous mixture of F-series prostaglandins promotes sperm guidance in the C. elegans reproductive tract. PLoS Genetics. 9 (1), e1003271 (2013).
- Golovko, M. Y., Murphy, E. J. An improved LC-MS/MS procedure for brain prostanoid analysis using brain fixation with head-focused microwave irradiation and liquid-liquid extraction. J. Lipid Res. 49, 893-902 (2008).
- Murphy, R. C., et al. Electrospray ionization and tandem mass spectrometry of eicosanoids. Anal. Biochem. 346, 1-42 (2005).
- Milne, G. L., Yin, H., Morrow, J. D.
- Lehtonen, M., Reisner, K., Auriola, S., Wong, G., Callaway, J. C. Mass-spectrometric identification of anandamide and 2-arachidonoylglycerol in nematodes. Chem. Biodivers. 5, 2431-2441 (2008).
- Kulas, J., Schmidt, C., Rothe, M., Schunck, W. H., Menzel, R. Cytochrome P450-dependent metabolism of eicosapentaenoic acid in the nematode Caenorhabditis elegans. Arch. Biochem. Biophys. 472, 65-75 (2008).
- Watts, J. L., Browse, J. Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).
