Abstract
Oxigenação simultânea e monitoramento de fatores de glicose no acoplamento estímulo-secreção em uma única técnica é fundamental para a modelagem de estados fisiopatológicos da ilhota hipóxia, especialmente em ambientes de transplantes. Técnicas de câmara de hipóxia padrão não pode modular os estímulos, ao mesmo tempo, nem fornecer monitoramento em tempo real dos fatores de glicose no acoplamento estímulo-secreção. Para superar estas dificuldades, aplicamos uma técnica de micro várias camadas de integrar tanto aquosa e modulações de fase gasosa através de uma membrana de difusão. Isto cria uma sanduíche estimulação em torno das ilhotas microscaled dentro do polidimetilsiloxano transparente dispositivo (PDMS), que permita o controlo dos factores de acoplamento acima mencionadas, através de microscopia de fluorescência. Além disso, a entrada de gás é controlado por um par de microdispensers, proporcionando, modulações quantitativos sub-hora de oxigénio entre 0-21%. Esta hipóxia intermitente é aplicada para investigar um novo fenômeno da ilhat pré-condicionamento. Além disso, armado com microscopia multimodal, fomos capazes de olhar para o cálcio detalhada e dinâmica do canal K ATP durante esses eventos hipóxicos. Nós encaramos hipóxia microfluídica, especialmente a técnica de dupla fase simultânea, como uma valiosa ferramenta no estudo de ilhotas, assim como muitos ex vivo tecidos.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagent/Material | |||
Spinner | Laurell | WS-400 | |
SU8 | MicroChem | SU8-2150/SU8-2100 | |
Digital Hotplate | PMC Dataplate | 722A | |
UV Curing Lamp | OmniCure | S1000 | |
PMDS | Dow Chemical | Sylgard 184 | |
Corona Wand | ETP | BD-20AC | |
Vacuum Chamber | Bel-Art | 420220000 | |
Microdispensers | The Lee Company | IKTX0322000A | |
5 V and 20 V DC Power | Radio Shack | ||
NI USB | National Instrument | NI USB-6501 | |
Thermometer | Omega Engineering, Inc. | ||
Peristaltic Pump | Gilson | Minipulse 2 | |
Oxygen Sensor | Ocean Optics | NeoFox | |
Fraction Collector | Gilson | 203 | |
Pippette | Fisher Scientific | Finnpipette II 100μl | |
Inverted Epifluorescence Microscope | Leica | DMI 4000B | |
50 ml Conical Tubes | Fisher Scientific | ||
Fura-2 Fluorescence Dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
Rhodamine 123 Fluorescence Dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
Culture Media | Sigma-Aldrich | RPMI-1640 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | ||
Glucose | Sigma-Aldrich | ||
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | ||
30 in Silicone Tubings | Cole-Parmer | 1/16 in x 1/8 in | |
1.5 ml Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | ||
Y-connectors | Cole-Parmer | 1/16 in and 4 mm | |
Syringe Connectors | Cole-Parmer | female Luer plug 1/16 in | |
Straight Connectors | Cole-Parmer | 1/16 in | |
Elbow Connector | Cole-Parmer | 1/16 in |
References
- Lo, J. F., Wang, Y., et al. Islet Preconditioning via Multimodal Microfluidic Modulation of Intermittent Hypoxia. Anal. Chem. 84 (4), 1987-1993 (2012).
- Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue. J. Vis. Exp.. , e1125 (2009).
- Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets. J. Vis. Exp.. , e1343 (2009).
- Shapiro, A. M., et al. Islet Transplantation in Seven Patients with Type 1 Diabetes Mellitus Using a Glucocorticoid-Free Immunosuppressive Regimen. N. Engl. J. Med. 343 (4), 230-238 (2000).
- Adewola, A. F., Wang, Y., Harvat, T., Eddington, D. T., Lee, D., Oberholzer, J. A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device. J. Vis. Exp.. , e1649 (2010).
- Mohammed, J. S., Wang, Y., Harvat, T. A., Oberholzer, J., Eddington, D. T. Microfluidic device for multimodal characterization of pancreatic islets. Lab Chip. 9, 97-106 (2009).
- Carreras, A., Kayali, F., Zhang, J., Hirotsu, C., Wang, Y., Gozal, D. Metabolic Effects Of Intermittent Hypoxia In Mice: Steady Versus High Frequency Applied Hypoxia Daily During The Rest Period. AJP - Regu Physiol. 303 (7), 700-709 (2012).
- Lee, E. J., et al. Time-dependent changes in glucose and insulin regulation during intermittent hypoxia and continuous hypoxia. Eur. J. Appl. Physiol. , (2012).
- Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes. Anal. Chem. 78, 4291-4298 (2006).
- Lam, R. H. W., Kim, M. C., Thorsen, T. Culturing aerobic and anaerobic bacteria and mammalian cells with a microfluidic differential oxygenator. Anal. Chem. 81, 5918-5924 (2009).
- Polinkovsky, M., Gutierrez, E., Levchenko, A., Groisman, A. Fine temporal control of the medium gas content and acidity and on-chip generation of series of oxygen concentrations for cell cultures. Lab Chip. 9, 1073-1084 (2009).
- Mehta, G., et al. Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture. Biomed. Microdev. 9 (2), 123-134 (2007).
- Vollmer, A. P., Probstein, R. F., Gilbert, R., Thorsen, T. Development of an integrated microfluidic platform for dynamic oxygen sensing and delivery in a flowing medium. Lab Chip. 5, 1059-1066 (2005).
- Chen, Y., et al. Generation of oxygen gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially confined chemical reactions. Lab Chip. 11, 3626-3633 (2011).
- Lo, J. F., Sinkala, E., Eddington, D. T. Oxygen gradients for open well cellular cultures via microfluidic substrates. Lab Chip. 10, 2394-2401 (2010).