Трансплантация лица в<em> Xenopus Laevis</em> Эмбрионы
Summary
Методика пересадки "Экстремальный Передней домен" лицевой ткани между Xenopus Laevis эмбрионы была разработана. Ткань может быть перемещен из одного гена фоне выражения в другую, что позволяет изучение местных требований к черепно-лицевого развития и для взаимодействия между регионами лица сигнализации.
Abstract
Черепно-лицевые врожденные дефекты встречаются в 1 из каждых 700 родившихся живыми, но этиология редко известны в связи с ограниченным пониманием черепно-лицевого развития. Чтобы определить, где сигнальные пути и тканей действовать во паттерна развивающихся лице, методика "пересадка лица" была разработана в зародышах лягушки Xenopus Laevis. Область предполагаемого лицевой ткани («Экстрим Передняя Domain" (ЕАД)) удаляется из донорской эмбриона на стадии хвостовой почки, и пересадить к хост эмбриона одной сцене, из которого эквивалентна область была удалена. Это может быть использовано, чтобы генерировать химерный лицо, где хозяин или донор ткани имеет потерю или усиление функции в гене, и / или включает метку линии. После заживления, исход развития контролируется, и указывает роли сигнального пути в донора или окружающих тканях хозяина. Xenopus является ценным образцом для развития лица, так как регион лица большой и легкоccessible для микроманипуляций. Многие эмбрионы могут быть проанализированы, в течение короткого периода времени, так как развитие происходит быстро. В ходе проверки этой лягушки актуальны для развития человека, так как черепно-лицевые процессы появляются сохраняется между Xenopus и млекопитающих.
Introduction
Чтобы понять механизмы, лежащие черепно-лицевые врожденные дефекты 1-2, важные ткани и их сигнальные взносов в течение черепно-лицевого развития должны быть определены. В лягушка Xenopus Laevis, части лица, в том числе полости рта и ноздрей форме от "Extreme Передняя Domain" (EAD), где эктодерма и энтодерма непосредственно примыкающего 3-4. EAD также действует как центр сигнализации влиять окружающие ткани, в том числе черепа нервного гребня, который образует челюсти и другие области лица 5. Чтобы идентифицировать гены, которые способствуют функции EAD, методика «пересадка лица" был разработан, где ткань пересаживается от донора в хозяйскую эмбриона, после удаления соответствующего хоста регион. После пересадки, в результате развития лица оценивается. Таким образом, эффекты потери функции (LOF) или усиления функции (GOF) для конкретного гена в EAD проанализированы на месте, где остальная часть чEAD и тело состоит из дикого типа ткани. Взаимное пересадка может быть выполнена, где дикого типа ткани пересаживается в эмбрионов с глобальной LOF или GOF в специфических генов. Трансплантация была часто используется в Xenopus и цыпленок изучает 6. Например, трансплантация Xenopus обратился homogenetic нейронной индукции, объектив и нейронной компетентность, и нервного гребня миграции 7-10. Перепела-цыпленок химерные прививки проанализировал развитие передней части нервной пластинки, передней части нервной хребта, нервного гребня и костей черепа 11-14. Это первый метод пересадки для изучения черепно-лицевого развития в Xenopus. Эта техника продемонстрировала новую роль ингибиторов Wnt Frzb1 и Полумесяца в регулировании образование базальной мембраны в презумптивной рта 5. Xenopus Laevis является идеальной моделью для изучения черепно-лицевого развития как эмбрионы большие, развивать внешне,й лицо хорошо видна, позволяя микроманипуляция и визуализации развития. Механизмы, лежащие в основе развития лица появляются сохраняется, указывая, что выводы, сделанные в лягушку обеспечить понимание человеческого развития 4,15-16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Критические шаги и ограничения: Процедура трансплантации лица ЕАД время и работать интенсивно. Это требует практики, устойчивые руки, и ловкость, чтобы усовершенствовать. Протокол пересадка лица зависит от способности исследователя эффективного удаления и пересадки тканей. Если ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Radek Šindelka за помощь и Cas Bresilla для оказания помощи с лягушкой хозяйства и подготовки эмбриона. Эта работа финансировалась NIH через грант R01DE021109 к HLS Лаура Jacox финансировалось Гершель Смит стипендий в Гарвардском университете и F30 индивидуальный стипендии, F30DE022989-01 через NIDCR.
Materials
| Pasteur pipette | VWR | 14672-400 | Lime Glass |
| Size 5 3/4’’ | Cotton Plugged | ||
| Disposable | |||
| Graduated Transfer Pipette | VWR | 16001-180 | Disposable |
| Polyethylene | |||
| #5/45 forceps | Fine Science Tools by Dupont medical | 11251-35 | Angled 45 degrees |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-20 | Straight; serrated tip |
| Stainless Steel; | |||
| 20cm long | |||
| Capillary Tubing (for needles) | FHC | 30-30-1 | Borosil 1.0mm OD x 0.5mm ID/Fiber |
| 100mm each | |||
| Cover slip | VWR | 48393 252 | 24x60mm |
| micro cover glass | or | or | |
| (for glass bridges) | 48393 230 | 24x40mm | |
| No.1.5 | |||
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F9378 | |
| Needle Puller | Sutter Instrument Co | Needle Puller: discontinued Filament: FB300B | The most similar, currently available needle puller is the P-97. For filaments, use Sutter 3.00mm square box filaments, 3.0mm wide. |
| Model P-80 | Flaming / Brown micropipette puller | ||
| (discontinued) | |||
| Stereomicroscope | Zeiss | ||
| Zeiss Stemi 1000 | |||
| Stereomicroscope Lighting by Fostec | Fostec | Use a light box with 2 fiberoptic arms. | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26018-17 | Jaw Opening Diameter: 0 to 1mm |
| Length: 17cm | |||
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Jaw opening Diameter: 0 to 1mm |
| Length: 12cm | |||
| Tungsten Needles | Fine Science Tools | 10130-05 | 0.125mm Rod diameter |
| Van Aken Plastalina | Blick | #33268-2981 | |
| Modeling Clay- white, red or yellow | |||
| mMessage mMashine SP6 or T7 Kit | Ambion | AM1340 |
References
- Gorlin, R. J., Cohen, M., Levin, L. . Syndromes of the head and neck. , (1990).
- Trainor, P. Craniofacial birth defects: The role of neural crest cells in the etiology and pathogenesis of Treacher Collins syndrome and the potential for prevention. Am. J. Med. Gen. A. 152, 2984-2994 (2010).
- Dickinson, A. J., Sive, H. L. Development of the primary mouth in Xenopus laevis. Dev. Bio. 295, 700-713 (2006).
- Dickinson, A. J., Sive, H. L. Positioning the extreme anterior in Xenopus: cement gland, primary mouth and anterior pituitary. Sem. Cell Dev. Bio. 18, 525-533 (2007).
- Dickinson, A. J., Sive, H. L. The Wnt antagonists Frzb-1 and Crescent locally regulate basement membrane dissolution in the developing primary mouth. Dev. 136, 1071-1081 (2009).
- Gilbert, S. F. . Developmental Biology. , (2010).
- Borchers, A., Epperlein, H. H., Wedlich, D. An assay system to study migratory behavior of cranial neural crest cells in Xenopus. Dev. Genes Evol. 210, 217-222 (2000).
- Grunz, H. Homoiogenetic neural inducing activity of the presumptive neural plate of Xenopus laevis. Dev. Growth Differ. 32, 583-589 (1990).
- Servetnick, M., Grainger, R. M. Changes in neural and lens competence in Xenopus ectoderm: evidence for an autonomous developmental timer. Dev. Bio. 112, 177-188 (1991).
- Servetnick, M., Grainger, R. M. Homeogenetic neural induction in Xenopus. Dev. Bio. 147, 73-82 (1991).
- Couly, G., Coltey, P., Le Douarin, N. The triple origin of skull in higher vertebrates: a study in quail-chick chimeras. Dev. 117, 409-429 (1993).
- Couly, G. F., Le Douarin, N. M. Mapping of the early neural primordium in quail-chick chimeras : I. Developmental relationships between placodes, facial ectoderm. 110, 422-439 (1985).
- Couly, G. F., Le Douarin, N. M. Mapping of the early neural primordium in quail-chick chimeras II. The prosencephalic neural plate and neural folds: Implications for the genesis of cephalic human congenital abnormalities. Dev. Bio. 120, 198-214 (1987).
- Lievre, A. L., Le Douarin, N. The early development of cranial sensory ganglia and the potentialities of their component cells studied in quail-chick chimeras. Dev. Bio. 94, 291-310 (1982).
- Kennedy, A., Dickinson, A. Median facial clefts in Xenopus laevis: roles of retinoic acid signaling and homeobox genes. Dev. Bio. 365, 229-240 (2012).
- Trainor, P., Tam, P. Cranial paraxial mesoderm and neural crest of the mouse embryo- codistribution in the craniofacial mesenchyme but distinct segregation in the branchial arches. Dev. 121, 2569-2582 (1995).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early Development of Xenopus laevis. , (2000).
- Tandon, P., Showell, C., Christine, K., Conlon, F. Morpholino injection in Xenopus. Methods Mol. Biol. 843, 29-46 (2012).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1994).
