Yüz Nakli<em> Xenopus laevis</em> Embriyolar
Summary
Xenopus arasında yüz doku "Extreme Anterior Etki" nakli için bir tekniktir embriyolar geliştirilmiştir laevis'den. Doku kraniofasial gelişimi için ve yüz bölgeleri arasındaki etkileşimleri sinyalizasyon için yerel gereksinimleri çalışma izin, başka içine bir gen ekspresyon kökenli taşınmış olabilir.
Abstract
Doğumsal kusurları 1 700 her canlı doğumda bir görülür, ancak etyolojisi nadiren nedeniyle kraniofasiyal gelişme sınırlı anlayış bilinmektedir. Sinyal yolları ve dokular gelişen yüzün desenleme sırasında hareket nerede olduğunu belirlemek için, bir 'yüz nakli' tekniği kurbağa Xenopus laevis embriyoların geliştirilmiştir. Olası yüz kağıt ürün ("Extreme Ön Alan" (EAD)) ihtiva eden bir bölge tailbud aşamada bir verici embriyo kaldırılır ve eşdeğer bölgesi kaldırıldı ki aynı aşaması bir dizi embriyo, transplante edilir. Bu, bir ana bilgisayar veya donor dokusu, bir gende bir kayıp ya da fonksiyon kazancı ve / veya bir soy etiket içeren bir kimerik bir yüz oluşturmak için de kullanılabilir. Yüz bölgesi kolayca büyük ve gibi şifa sonra, gelişme sonuç izlenen ve vericiden veya çevredeki konak dokularının içindeki sinyal yolunun rollerini işaret edilir. Ksenopus, yüz gelişimi için değerli bir model birmikromanipülasyon için ccessible. Geliştirme hızla meydana geldiği çoğu embriyolar, kısa bir süre boyunca, tahlil edilebilir. Kraniofasial süreçler Xenopus ve memeliler arasında korunmuş görünen bu yana kurbağa bulguları, insan gelişimi ile ilgili bulunmaktadır.
Introduction
Kraniyofasiyal gelişimi sırasında doğumsal kusurları 1-2, önemli dokuları ve onların sinyal katkılarını altında yatan mekanizmaları anlamak için tespit edilmelidir. Kurbağa Xenopus laevis, ektoderm ve endoderm doğrudan 3-4 yan yana olan "Extreme Anterior Domain" (EAD), gelen ağız ve burun delikleri formu dahil olmak üzere yüzün bir parçası olarak. EAD ayrıca çene ve diğer yüz bölgelerini oluşturan 5 kranial nöral, dahil çevredeki dokuları etkilemek için bir sinyal merkezi olarak görür. Doku gelen konak bölgeyi çıkardıktan sonra, bir ev sahibi embriyo bir donörden nakledilen nerede EAD işlevine katkıda genleri tanımlamak için, bir 'yüz nakli' tekniği geliştirildi. Nakilden sonra, yüz gelişme elde değerlendirilir. Böylece, fonksiyon kaybı (LOF) ya da EAD belirli bir genin fonksiyonu (GOF) kazancı etkisi, yerel olarak incelendiğinde burada h geri kalanıead ve vücut vahşi tip dokusu oluşur. Vahşi tip dokuya özgü gen, küresel LOFveya GOF olan embriyoların içine nakledilen olduğu karşılıklı nakli, gerçekleştirilebilir. Transplantasyon sık Xenopus'ta kullanılan ve civciv 6 inceler. Örneğin, Ksenopus nakli homogenetic nöral indüksiyon, lens ve nöral yetkinlik ve nöral krest göç 7-10 ele almıştır. Bıldırcın-civciv kimerik aşılama anterior nöral plaka, anterior nöral sırt, nöral ve kafatası kemikleri 11-14 gelişimini analiz etti. Bu Xenopus kraniofasiyal geliştirme çalışması için ilk nakil tekniktir. Bu teknik olası ağız 5 bazal membran oluşumunu düzenleyen Wnt önleyicileri Frzb1 ve Crescent için yeni bir rolü olduğunu göstermiştir. Xenopus laevis kraniofasiyal geliştirme çalışması için ideal bir model embriyo büyük olarak, harici bir geliştirmend yüz sağlayan, kolayca görülebilir mikromanipülasyon ve gelişim görüntüleme. Yüz gelişimini yatan mekanizmalar kurbağa yapılan bulgular, insan gelişiminin 4,15-16 içgörü sağlamak olduğunu belirten, korunmuş görünür.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritik Adımlar ve Sınırlamalar: EAD yüz nakli işlem süresi ve yoğun çalışır. Bu mükemmel uygulama, sürekli elleri ve maharet gerektirir. Yüz nakli protokol verimli kaldırmak ve nakli doku için araştırmacının becerisine dayanır. Bir konağın yüzüne nakli eklemek için çok uzun sürerse, konak yüz sözleşme ve iyileştirmeye başlayacak. Forseps ince yüz bölgesini genişletmek için kullanılabilir. Önemli yara daralma oluştu Ancak, nakli de iyileşme olmaz ve konağın yüz deliğe s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz kurbağa yetiştiriciliği ve embriyo hazırlanmasına yardımcı için yaptığı yardım için Radek Sindelka ve Cas Bresilla teşekkür ederim. Bu çalışma HLS Laura Jacox için hibe R01DE021109 yoluyla NIH tarafından finanse edildi Harvard Üniversitesi'nde Herschel Smith Yüksek Lisans Bursu ve F30 bireysel burs hibe F30DE022989-01 NIDCR aracılığıyla tarafından finanse edildi.
Materials
| Pasteur pipette | VWR | 14672-400 | Lime Glass |
| Size 5 3/4’’ | Cotton Plugged | ||
| Disposable | |||
| Graduated Transfer Pipette | VWR | 16001-180 | Disposable |
| Polyethylene | |||
| #5/45 forceps | Fine Science Tools by Dupont medical | 11251-35 | Angled 45 degrees |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-20 | Straight; serrated tip |
| Stainless Steel; | |||
| 20cm long | |||
| Capillary Tubing (for needles) | FHC | 30-30-1 | Borosil 1.0mm OD x 0.5mm ID/Fiber |
| 100mm each | |||
| Cover slip | VWR | 48393 252 | 24x60mm |
| micro cover glass | or | or | |
| (for glass bridges) | 48393 230 | 24x40mm | |
| No.1.5 | |||
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F9378 | |
| Needle Puller | Sutter Instrument Co | Needle Puller: discontinued Filament: FB300B | The most similar, currently available needle puller is the P-97. For filaments, use Sutter 3.00mm square box filaments, 3.0mm wide. |
| Model P-80 | Flaming / Brown micropipette puller | ||
| (discontinued) | |||
| Stereomicroscope | Zeiss | ||
| Zeiss Stemi 1000 | |||
| Stereomicroscope Lighting by Fostec | Fostec | Use a light box with 2 fiberoptic arms. | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26018-17 | Jaw Opening Diameter: 0 to 1mm |
| Length: 17cm | |||
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Jaw opening Diameter: 0 to 1mm |
| Length: 12cm | |||
| Tungsten Needles | Fine Science Tools | 10130-05 | 0.125mm Rod diameter |
| Van Aken Plastalina | Blick | #33268-2981 | |
| Modeling Clay- white, red or yellow | |||
| mMessage mMashine SP6 or T7 Kit | Ambion | AM1340 |
References
- Gorlin, R. J., Cohen, M., Levin, L. . Syndromes of the head and neck. , (1990).
- Trainor, P. Craniofacial birth defects: The role of neural crest cells in the etiology and pathogenesis of Treacher Collins syndrome and the potential for prevention. Am. J. Med. Gen. A. 152, 2984-2994 (2010).
- Dickinson, A. J., Sive, H. L. Development of the primary mouth in Xenopus laevis. Dev. Bio. 295, 700-713 (2006).
- Dickinson, A. J., Sive, H. L. Positioning the extreme anterior in Xenopus: cement gland, primary mouth and anterior pituitary. Sem. Cell Dev. Bio. 18, 525-533 (2007).
- Dickinson, A. J., Sive, H. L. The Wnt antagonists Frzb-1 and Crescent locally regulate basement membrane dissolution in the developing primary mouth. Dev. 136, 1071-1081 (2009).
- Gilbert, S. F. . Developmental Biology. , (2010).
- Borchers, A., Epperlein, H. H., Wedlich, D. An assay system to study migratory behavior of cranial neural crest cells in Xenopus. Dev. Genes Evol. 210, 217-222 (2000).
- Grunz, H. Homoiogenetic neural inducing activity of the presumptive neural plate of Xenopus laevis. Dev. Growth Differ. 32, 583-589 (1990).
- Servetnick, M., Grainger, R. M. Changes in neural and lens competence in Xenopus ectoderm: evidence for an autonomous developmental timer. Dev. Bio. 112, 177-188 (1991).
- Servetnick, M., Grainger, R. M. Homeogenetic neural induction in Xenopus. Dev. Bio. 147, 73-82 (1991).
- Couly, G., Coltey, P., Le Douarin, N. The triple origin of skull in higher vertebrates: a study in quail-chick chimeras. Dev. 117, 409-429 (1993).
- Couly, G. F., Le Douarin, N. M. Mapping of the early neural primordium in quail-chick chimeras : I. Developmental relationships between placodes, facial ectoderm. 110, 422-439 (1985).
- Couly, G. F., Le Douarin, N. M. Mapping of the early neural primordium in quail-chick chimeras II. The prosencephalic neural plate and neural folds: Implications for the genesis of cephalic human congenital abnormalities. Dev. Bio. 120, 198-214 (1987).
- Lievre, A. L., Le Douarin, N. The early development of cranial sensory ganglia and the potentialities of their component cells studied in quail-chick chimeras. Dev. Bio. 94, 291-310 (1982).
- Kennedy, A., Dickinson, A. Median facial clefts in Xenopus laevis: roles of retinoic acid signaling and homeobox genes. Dev. Bio. 365, 229-240 (2012).
- Trainor, P., Tam, P. Cranial paraxial mesoderm and neural crest of the mouse embryo- codistribution in the craniofacial mesenchyme but distinct segregation in the branchial arches. Dev. 121, 2569-2582 (1995).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early Development of Xenopus laevis. , (2000).
- Tandon, P., Showell, C., Christine, K., Conlon, F. Morpholino injection in Xenopus. Methods Mol. Biol. 843, 29-46 (2012).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1994).
