顔面移植<em>アフリカツメガエル</em>胚
Summary
アフリカツメガエル胚の間の顔の組織が 開発された「エクストリーム前部ドメイン」移植する技術。組織は、頭蓋顔面および開発のための顔領域間の相互作用をシグナリングするための地域の要件の研究を可能にする、別に1つの遺伝子発現のバックグラウンドを移動させることができる。
Abstract
頭蓋顔面の先天性欠損症は、すべて700出生のうち1つで発生したが、病因はほとんどのため、頭蓋顔面の開発の限られた理解に知られていない。シグナル伝達経路や組織が 発達顔のパターン形成中に行動する場所を特定するには、「顔面移植」技術はカエルアフリカツメガエルの胚で開発された。推定ティッシュ（「エクストリーム前方ドメイン」（EAD））の領域は、尾芽段階でドナー胚から除去され、同等の領域が除去された同じステージの宿主胚に移植する。これは、ホストまたはドナー組織は遺伝子機能の損失又は利得を有し、および/または系統標識を含むキメラ面を生成するために使用することができる。顔領域を容易に大規模であり、次のように治癒した後、現像の結果を監視し、ドナー又は周囲の宿主組織内シグナル伝達経路の役割を示している。 アフリカツメガエルは 、顔の開発のための貴重なモデルであるマイクロマニピュレーション用ccessible。多くの胚は、開発が急速に起こるため、短い期間にわたって、アッセイすることができる。頭蓋顔面のプロセスは、アフリカツメガエルと哺乳類の間で保存現れるので、カエルでの調査結果は、人間開発に関連している。
Introduction
頭蓋顔面の先天性欠損症1〜2のメカニズムを理解するために、頭蓋顔面の開発における重要な組織とそのシグナル伝達の寄与が特定されなければならない。カエルアフリカツメガエル、外胚葉と内胚葉、直接3-4並置されている「エクストリーム前歯ドメイン」（EAD）、から口や鼻の穴の形を含む顔の一部では、。 EADはまた、顎や他の顔領域5を形成し 、頭蓋神経堤など、周囲の組織に影響を与えるために、シグナリング·センターとして機能します。組織が対応するホスト領域を除去した後に、ホスト胚にドナーから移植されている場合、EADの機能に寄与する遺伝子を同定するために、「顔面移植」技術は、開発されました。移植後、顔の発達を生じることは評価される。このように、機能の喪失（LOF）またはEAD内の特定の遺伝子のための機能（GOF）の利得の効果は、局部的に分析したところ、Hの残りの部分EADと体は、野生型組織から構成されている。野生型組織特異的遺伝子のグローバルLOFまたはGOFを有する胚に移植される移植逆数を行うことができる。移植は、しばしば、アフリカツメガエルおよびニワトリの試験6で用いられてきた。例えば、 アフリカツメガエルの移植が単純発生の神経誘導、レンズや神経の能力、および神経堤の移行7月10日に対処しています。ウズラ、ひよこキメラ移植は、前神経板、前方神経尾根、神経堤、および頭蓋骨11月14日の開発を分析しました。これは、この技術は、推定口5に基底膜形成の調節におけるWnt阻害剤Frzb1、クレセントための新たな役割を実証してきました。アフリカツメガエルにおける頭蓋顔面の開発研究のための最初の移植技術です。 アフリカツメガエル頭蓋顔面の開発の研究のための理想的なモデルです。胚が大きいように、外部の開発ND顔は、開発のマイクロマニピュレーションとイメージングを可能に容易に見ることができる。顔の開発の基礎となるメカニズムはカエルで行われた調査結果は、人間開発4,15-16への洞察を提供することを示し、保存され表示されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
重要なステップと制限：EADの顔面移植の手順は時間であり、集中して作業。それは完璧に練習、着実に手や器用さを必要とします。顔面移植プロトコルは、効率的に組織を除去し、移植する研究者の能力に依存しています。 1ホストの顔を移植を挿入するためには長すぎるがかかる場合は、ホストの顔は収縮し、癒すために開始されます。鉗子は、微妙に顔領域を拡張するために使用す…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、カエルの飼育および胚の準備を支援するために彼の助けのためのラデクSindelka、およびCAS Bresillaに感謝します。この作品は、HLSローラ·Jacoxに付与R01DE021109を経由して、NIHによって資金を供給されたが、ハーバード大学のハーシェル·スミス大学院フェローシップとF30の個々のフェローシップ助成F30DE022989-01 NIDCRを通してによって資金を供給された。
Materials
| Pasteur pipette | VWR | 14672-400 | Lime Glass |
| Size 5 3/4’’ | Cotton Plugged | ||
| Disposable | |||
| Graduated Transfer Pipette | VWR | 16001-180 | Disposable |
| Polyethylene | |||
| #5/45 forceps | Fine Science Tools by Dupont medical | 11251-35 | Angled 45 degrees |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-20 | Straight; serrated tip |
| Stainless Steel; | |||
| 20cm long | |||
| Capillary Tubing (for needles) | FHC | 30-30-1 | Borosil 1.0mm OD x 0.5mm ID/Fiber |
| 100mm each | |||
| Cover slip | VWR | 48393 252 | 24x60mm |
| micro cover glass | or | or | |
| (for glass bridges) | 48393 230 | 24x40mm | |
| No.1.5 | |||
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F9378 | |
| Needle Puller | Sutter Instrument Co | Needle Puller: discontinued Filament: FB300B | The most similar, currently available needle puller is the P-97. For filaments, use Sutter 3.00mm square box filaments, 3.0mm wide. |
| Model P-80 | Flaming / Brown micropipette puller | ||
| (discontinued) | |||
| Stereomicroscope | Zeiss | ||
| Zeiss Stemi 1000 | |||
| Stereomicroscope Lighting by Fostec | Fostec | Use a light box with 2 fiberoptic arms. | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26018-17 | Jaw Opening Diameter: 0 to 1mm |
| Length: 17cm | |||
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Jaw opening Diameter: 0 to 1mm |
| Length: 12cm | |||
| Tungsten Needles | Fine Science Tools | 10130-05 | 0.125mm Rod diameter |
| Van Aken Plastalina | Blick | #33268-2981 | |
| Modeling Clay- white, red or yellow | |||
| mMessage mMashine SP6 or T7 Kit | Ambion | AM1340 |
References
- Gorlin, R. J., Cohen, M., Levin, L. . Syndromes of the head and neck. , (1990).
- Trainor, P. Craniofacial birth defects: The role of neural crest cells in the etiology and pathogenesis of Treacher Collins syndrome and the potential for prevention. Am. J. Med. Gen. A. 152, 2984-2994 (2010).
- Dickinson, A. J., Sive, H. L. Development of the primary mouth in Xenopus laevis. Dev. Bio. 295, 700-713 (2006).
- Dickinson, A. J., Sive, H. L. Positioning the extreme anterior in Xenopus: cement gland, primary mouth and anterior pituitary. Sem. Cell Dev. Bio. 18, 525-533 (2007).
- Dickinson, A. J., Sive, H. L. The Wnt antagonists Frzb-1 and Crescent locally regulate basement membrane dissolution in the developing primary mouth. Dev. 136, 1071-1081 (2009).
- Gilbert, S. F. . Developmental Biology. , (2010).
- Borchers, A., Epperlein, H. H., Wedlich, D. An assay system to study migratory behavior of cranial neural crest cells in Xenopus. Dev. Genes Evol. 210, 217-222 (2000).
- Grunz, H. Homoiogenetic neural inducing activity of the presumptive neural plate of Xenopus laevis. Dev. Growth Differ. 32, 583-589 (1990).
- Servetnick, M., Grainger, R. M. Changes in neural and lens competence in Xenopus ectoderm: evidence for an autonomous developmental timer. Dev. Bio. 112, 177-188 (1991).
- Servetnick, M., Grainger, R. M. Homeogenetic neural induction in Xenopus. Dev. Bio. 147, 73-82 (1991).
- Couly, G., Coltey, P., Le Douarin, N. The triple origin of skull in higher vertebrates: a study in quail-chick chimeras. Dev. 117, 409-429 (1993).
- Couly, G. F., Le Douarin, N. M. Mapping of the early neural primordium in quail-chick chimeras : I. Developmental relationships between placodes, facial ectoderm. 110, 422-439 (1985).
- Couly, G. F., Le Douarin, N. M. Mapping of the early neural primordium in quail-chick chimeras II. The prosencephalic neural plate and neural folds: Implications for the genesis of cephalic human congenital abnormalities. Dev. Bio. 120, 198-214 (1987).
- Lievre, A. L., Le Douarin, N. The early development of cranial sensory ganglia and the potentialities of their component cells studied in quail-chick chimeras. Dev. Bio. 94, 291-310 (1982).
- Kennedy, A., Dickinson, A. Median facial clefts in Xenopus laevis: roles of retinoic acid signaling and homeobox genes. Dev. Bio. 365, 229-240 (2012).
- Trainor, P., Tam, P. Cranial paraxial mesoderm and neural crest of the mouse embryo- codistribution in the craniofacial mesenchyme but distinct segregation in the branchial arches. Dev. 121, 2569-2582 (1995).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early Development of Xenopus laevis. , (2000).
- Tandon, P., Showell, C., Christine, K., Conlon, F. Morpholino injection in Xenopus. Methods Mol. Biol. 843, 29-46 (2012).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1994).
