脂肪組織の免疫細胞の単離
Summary
脂肪組織（AT）が激しい免疫細胞の活性化および相互作用の部位である。免疫系のほぼ全ての細胞は、ATに存在し、それらの比は肥満によって変更される。免疫細胞集団ATの適切な分離、定量化、および特性はimmunometabolic病気で自分の役割を理解するために重要である。
Abstract
肥満の齧歯類およびヒトの脂肪組織の増加マクロファージ浸潤（AT）の発見は、局所および全身インスリン抵抗性免疫細胞の寄与の関心の増大につながっている。リーンと肥満のさまざまな免疫細胞集団の単離と定量AT今immunometabolismの研究室で一般的に利用技術です。まだ細心の注意を得られたデータは、信頼性と解釈可能であるように間質血管細胞の分離やフローサイトメトリー分析の両方に注意しなければならない。このビデオでは、ダイジェストをミンチし、免疫細胞に富む間質血管の一部を分離する方法を示します。その後、我々は、抗体ラベルマクロファージとTリンパ球と方法、フローサイトメトリー実験でそれらに適切にゲートにする方法を示しています。低脂肪で育てリーン及び高脂肪給餌肥満マウスからの代表的フローサイトメトリープロットが設けられている。この分析の重要な要素は、何の抗体を使用することであるマクロファージで自然自家蛍光であるチャンネルだけでなく、適切な補償コントロールの使用で蛍光を発するではない。
Introduction
歴史的には、脂肪組織（AT）は、エネルギーバランスに応じて伸縮する脂質貯蔵、不活性器官として見てきた。我々は今、ATが積極的に直接摂食行動と全身のグルコース恒常性に影響を与えるホルモンの数を分泌する動的な内分泌器官を表していることを理解しています。また、過去十年間の間質血管画分（SVF）と同様に、ATホメオスタシスへの貢献ATに存在する免疫細胞の多数の人口の増加感謝があった。
差動遠心し脂肪細胞とコラゲナーゼダイジェストを使用してSVF AT分離する能力は、最初1964年1 Rodbellによって記述されていた。コラゲナーゼIIは、ほとんどの場合、脂肪細胞のインスリン受容体1のメンテナンスのため、脂肪細胞とSVF分離のために使用される。 ATの早い段階で、酵素分画は主に脂肪を研究するために採用されました代謝をcyteと脂肪前駆細胞を分離する。最近になって、フローサイトメーターの普及状況と市販のフルオロフォア標識抗体の増え続けると組み合わせこの技術は、免疫細胞ATの特徴付けを容易にしている。
AT炎症における免疫細胞の存在は以前に2に記載されていたが、ワイズバーグらによる精液の論文。とXu ら 。 2003年に出版さは、炎症性サイトカインを分泌し、AT-特定および全身インスリン抵抗3,4と相関肥満におけるマクロファージ（ATMの）、ATの蓄積を文書化することが最初でした。これらの観察結果は、調査の新たな分野の基礎は最近、 "immunometabolism、" 5造語を務め、樹状細胞6、肥満細胞7、T細胞8を含む様々な免疫細胞集団を、関与研究によってフォローアップされています–10、Bセル11、NKT細胞12、好酸球13、および肥満関連したインスリン抵抗性の発達中の好中球14,15。
この記事の目的は、SVF ATの細胞を単離するATMなどの特性を、フローサイトメトリーを介してT細胞ATするために使用されるコラゲナーゼ消化技術の詳細な説明を提供することである。このプロトコルは、ATマウスに最適化されていますが、視聴者は16で、人間のために、この手法の最適化に関する広範な詳細を提供する優れた記事を読んでから利益を得ることができる。この記事の対象読者は、限られた経験を持つ研究者でマウスを操作すると、フローサイトメトリーを実行を含む。時間とリソースを持つ細胞の収量と生存能力のバランスをとるためのいくつかの実用的な考慮事項は、免疫細胞集団AT特徴付けるためだけでなく、最適なフローサイトメトリーコントロールとして提示される。我々のプロトコルに加えて、読者は言及せている適切なコントロールと補償17を含むように、フローサイトメトリーの技術的な側面のいくつかの優れた議論のためのBasuさんらによる最近のJoveの記事への ED。
Protocol
Representative Results
Discussion
肥満の代謝結果における免疫系の役割への関心の高まりは、ATの免疫細胞を特徴付けるためにフローサイトメトリーの普及につながっている。正確なプロトコルは、独自の経験や利用可能な装置に基づいて研究室の間で異なりますが、重要なステップは、コラゲナーゼ消化、差遠心分離し、細胞表面抗原のラベルが含まれています。本記事の目的は、ATおよび/またはフローサイトメトリーを?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JSOはNIHルースL.キルシュNRSA（F32 DK091040）によってサポートされて、AKは米国糖尿病協会（7-10-MI-05）からのポストドクトラルフェローシップによってサポートされており、AHHは、米国心臓協会設立研究者賞によってサポートされています（12EIA8270000）。フローサイトメトリー実験は、リソース共有VMCフローサイトメトリーで行った。 VMCフローサイトメトリーの共有リソースがバンダービルト消化器病研究センター（DK058404）によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog # | |
| DPBS (no Ca or Mg) 10 x 500 ml | Life Technologies | 14190-250 | |
| DAPI | Life Technologies | D3571 | |
| BSA | Sigma | A2153-100G | |
| collagenase | Sigma | C6885-5G | |
| propidium iodide solution | Sigma | P4864-10 ml | |
| stable stack 20 microliter | Rainin | SS-L10 | |
| 20 microliter filter tips | Rainin | SRL10F | |
| stable stack 250 microliter tips | Rainin | SS-L250 | |
| 1000 microliter tips | Rainin | GPS-L1000 | |
| 1000 microliter filter tips | Rainin | GP-L1000F | |
| 250 microliter Filter Tips | Rainin | SR-L200F | |
| FC Block | BD Biosciences | 553142 | |
| fisher 100mn strainers | Fisherbrand | 22-363-549 | |
| medium weigh dish | Fisherbrand | 02-202B | |
| aluminum foil | Fisherbrand | 1213100 | |
| mincing scissors | Fisherbrand | 089531B | |
| Vortex | Fisherbrand | 2215365 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 14-959-49A | |
| filter top FACS tubes | BD Falcon | 352235 | |
| 10 ml pipette case 200 | BD Falcon | 1367520 | |
| round bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 5 ml syringe | BD Falcon | 309646 | |
| V Bottom Plates | Costar | 07-200-107 | |
| transfer bulb pipette | Thermo Scientific | 13-711-22 | |
| Shaker | Thermo Scientific | 11 676 071 | |
| Adhesive mat | Thermo Scientific | 1368750 | |
| Cell Culture Centrifuge | Sorvall | 75253839 | |
| Adapters | Sorvall | 75003723 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Concentration: 0.5 – 1 μg/ 106 cells |
| Rat anti-mouse F4/80 | eBioscience | 17-4801 | Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 17-4321 |
| Rat anti-mouse CD11b | eBioscience | 11-0112 | Fluorophore conjugate: FITC Concentration: 0.5 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 11/1/4031 |
| Armenian Hamster anti-mouse CD11c | eBioscience | 12-0114 | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: Dec-88 |
| Goat anti-mouse MGL1/2 | R&D Systems | FAB4297P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P |
| Goat anti-mouse CD206 | R&D Systems | FAB2535P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P |
| Rat anti-mouse CCR2 | R&D Systems | FAB5538P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC013P |
| Armenian Hamster anti-mouse TCRβ | BD Biosciences | 553174 | Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 553956 |
| Rat anti-mouse CD8a | BD Biosciences | 552877 | Fluorophore conjugate: PE-Cy7 Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 552784 |
| Rat anti-mouse CD4 | BD Biosciences | 557956 | Fluorophore conjugate: Alexa Fluor 700 Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 557963 |
Table 1. List of Materials and Reagents.
References
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