Isolamento de tecido adiposo de células imunes
Summary
O tecido adiposo (TA) é um site de ativação imune celular intensa e interação. Quase todas as células do sistema imune estão presentes em AT e as suas proporções são alteradas pela obesidade. Isolamento adequado, quantificação e caracterização de populações de células imunes são fundamentais para a compreensão do seu papel na doença immunometabolic.
Abstract
A descoberta de aumento de infiltração de macrófagos no tecido adiposo (TA) de roedores obesos e humanos conduziu a um interesse em intensificação da contribuição de células imunes à resistência à insulina local e sistémica. O isolamento e quantificação de populações de células imunitárias diferentes nos magros e obesos AT é agora uma técnica vulgarmente utilizada em laboratórios immunometabolism; Ainda extremo cuidado deve ser feita tanto no isolamento das células vasculares do estroma e na análise de citometria de fluxo, de modo que os dados obtidos são fiáveis e podem ser interpretados . Neste vídeo demonstramos como picar, digerir, e isolar a fração de células enriquecido estroma vascular imunológico. Posteriormente, vamos mostrar como anticorpos rótulo macrófagos e linfócitos T e como fazer corretamente portão los em experimentos de citometria de fluxo. Representante de citometria de fluxo de parcelas provenientes de gordura alimentados com ratos obesos alimentados com gordura de baixa magra e alta são fornecidos. Um elemento crítico da presente análise é o uso de anticorpos que fazemnão fluorescência nos canais onde a AT macrófagos são naturalmente autofluorescent, bem como o uso de controles de compensação adequados.
Introduction
Historicamente, o tecido adiposo (TA) tem sido visto como um órgão inerte de armazenamento de lípidos, a qual expande e contrai em resposta ao equilíbrio de energia. Agora entendemos que a AT representa um órgão endócrino dinâmico que secreta ativamente uma série de hormônios que influenciam diretamente no comportamento alimentar e homeostase da glicose sistêmica. Além disso, durante a última década tem havido uma apreciação crescente para as numerosas populações de células do sistema imunológico que residem na fracção vascular do estroma EM (SVF), bem como a sua contribuição para a AT homeostase.
A capacidade para separar o EM adipócito e SVF utilizando uma digest de colagenase seguido de centrifugação diferencial foi descrita pela primeira vez em 1964 por Rodbell 1. Colagenase II é mais frequentemente usado para a separação dos adipócitos e SVF devido à manutenção de receptores de insulina adipócitos 1. Logo no início, fracionamento enzimática da AT foi utilizada principalmente para estudar Adipocyte metabolismo e para isolar pré-adipócitos. Mais recentemente, essa técnica, combinada com a ampla disponibilidade de cytometers fluxo eo número cada vez maior de anticorpos a fluoróforos, disponíveis comercialmente, tem facilitado a caracterização da AT células do sistema imunológico.
Embora a presença de células imunes em inflamada no tinha sido descrita anteriormente 2, os papéis seminais de Weisberg et al. e Xu et al. publicado em 2003, foram os primeiros a documentar o acúmulo de AT macrófagos (ATMs) em obesidade, que secretam citocinas inflamatórias e correlacionar com a resistência à insulina AT específica e sistêmica 3,4. Estas observações serviu como a base de um novo campo de investigação recentemente inventado, "immunometabolism" 5, e foram acompanhados por estudos que implicam diferentes populações de células imunitárias, incluindo as células dendríticas, 6 7, mastócitos, células T 8 –10, as células B, células NK 11 12 13, eosinófilos e neutrófilos 14,15 no desenvolvimento da resistência à insulina associada a obesidade.
O objetivo deste artigo é a de proporcionar uma descrição pormenorizada da técnica de digestão de colagenase usada para isolar células da EM SVF e caracterizar ATMs e AT células T através de citometria de fluxo. Este protocolo foi otimizado para mouse AT, no entanto, os telespectadores podem se beneficiar da leitura de um excelente artigo que fornece muitos detalhes sobre a otimização da técnica para o ser humano aos 16 anos. O público-alvo deste artigo inclui investigadores com pouca experiência de trabalho com o mouse AT e realizando citometria de fluxo. Várias considerações práticas para equilibrar o rendimento ea viabilidade celular com o tempo e os recursos são apresentados, bem como os controles de citometria de fluxo ideais para a caracterização de populações de células imunes. Além do nosso protocolo, os leitores são remetidoed com um artigo recente da Jove Basu et al. uma excelente discussão de alguns dos aspectos técnicos da citometria de fluxo para incluir controles e compensações 17 adequadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
O interesse crescente no papel do sistema imunológico nas consequências metabólicas da obesidade levou à utilização generalizada de citometria de fluxo para caracterizar as células imunes do TA. Embora o protocolo exacto irá variar entre laboratórios com base na sua experiência e equipamentos disponíveis, os passos críticos incluem digestão com colagenase, a centrifugação diferencial, e o antigénio da superfície da célula de rotulagem. O objetivo do presente artigo é fornecer um protocolo detalhado e …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JSO é apoiado por um NIH Ruth L. Kirschstein NRSA (F32 DK091040), AK é apoiado por uma bolsa de pós-doutorado da American Diabetes Association (7-10-MI-05), e AHH é apoiado por um Heart Association Award americano Investigator Fundada (12EIA8270000). Experimentos de citometria de fluxo foram realizadas no VMC Citometria de Fluxo de Recursos Compartilhados. O VMC Citometria de Fluxo de recursos partilhada é apoiado pelo Digestive Disease Research Center Vanderbilt (DK058404).
Materials
| Name | Company | Catalog # | |
| DPBS (no Ca or Mg) 10 x 500 ml | Life Technologies | 14190-250 | |
| DAPI | Life Technologies | D3571 | |
| BSA | Sigma | A2153-100G | |
| collagenase | Sigma | C6885-5G | |
| propidium iodide solution | Sigma | P4864-10 ml | |
| stable stack 20 microliter | Rainin | SS-L10 | |
| 20 microliter filter tips | Rainin | SRL10F | |
| stable stack 250 microliter tips | Rainin | SS-L250 | |
| 1000 microliter tips | Rainin | GPS-L1000 | |
| 1000 microliter filter tips | Rainin | GP-L1000F | |
| 250 microliter Filter Tips | Rainin | SR-L200F | |
| FC Block | BD Biosciences | 553142 | |
| fisher 100mn strainers | Fisherbrand | 22-363-549 | |
| medium weigh dish | Fisherbrand | 02-202B | |
| aluminum foil | Fisherbrand | 1213100 | |
| mincing scissors | Fisherbrand | 089531B | |
| Vortex | Fisherbrand | 2215365 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 14-959-49A | |
| filter top FACS tubes | BD Falcon | 352235 | |
| 10 ml pipette case 200 | BD Falcon | 1367520 | |
| round bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 5 ml syringe | BD Falcon | 309646 | |
| V Bottom Plates | Costar | 07-200-107 | |
| transfer bulb pipette | Thermo Scientific | 13-711-22 | |
| Shaker | Thermo Scientific | 11 676 071 | |
| Adhesive mat | Thermo Scientific | 1368750 | |
| Cell Culture Centrifuge | Sorvall | 75253839 | |
| Adapters | Sorvall | 75003723 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Concentration: 0.5 – 1 μg/ 106 cells |
| Rat anti-mouse F4/80 | eBioscience | 17-4801 | Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 17-4321 |
| Rat anti-mouse CD11b | eBioscience | 11-0112 | Fluorophore conjugate: FITC Concentration: 0.5 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 11/1/4031 |
| Armenian Hamster anti-mouse CD11c | eBioscience | 12-0114 | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: Dec-88 |
| Goat anti-mouse MGL1/2 | R&D Systems | FAB4297P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P |
| Goat anti-mouse CD206 | R&D Systems | FAB2535P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P |
| Rat anti-mouse CCR2 | R&D Systems | FAB5538P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC013P |
| Armenian Hamster anti-mouse TCRβ | BD Biosciences | 553174 | Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 553956 |
| Rat anti-mouse CD8a | BD Biosciences | 552877 | Fluorophore conjugate: PE-Cy7 Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 552784 |
| Rat anti-mouse CD4 | BD Biosciences | 557956 | Fluorophore conjugate: Alexa Fluor 700 Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 557963 |
Table 1. List of Materials and Reagents.
References
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