Isolation von Fettgewebe Immune Cells
Summary
Fettgewebe (AT) ist ein Ort der intensiven Immunzellaktivierung und Interaktion. Fast alle Zellen des Immunsystems sind in AT und ihre Verhältnisse werden durch Fettleibigkeit verändert. Proper Isolierung, Quantifizierung und Charakterisierung von AT Immunzellpopulationen sind entscheidend für das Verständnis ihrer Rolle in immunometabolic Krankheit.
Abstract
Die Entdeckung erhöht Makrophageninfiltration im Fettgewebe (AT) von übergewichtigen Nagern und Menschen hat zu einer Intensivierung des Interesses an Immunzellen Beitrag zur lokalen und systemischen Insulinresistenz geführt. Isolierung und Quantifizierung der verschiedenen Immunzellpopulationen in schlanken und adipösen AT ist heute ein häufig genutzt Technik in immunometabolism Laboratorien; noch extremer Sorgfalt muss sowohl in Stromazellen vascular cell Isolation und in der Durchflusszytometrie-Analyse gemacht werden, so dass die erhaltenen Daten zuverlässig und interpretierbar ist . In diesem Video zeigen wir, wie man Hackfleisch, verdauen, und zu isolieren, das Immunsystem Zellen angereicherte Stromazellen vaskulären Fraktion. Anschließend zeigen wir, wie man Antikörper Label Makrophagen und T-Lymphozyten und wie man richtig Tor auf sie in der Durchflusszytometrie Experimente. Repräsentative Durchflusszytometrie Plots aus fettarm-fed schlank und fettreichen-fed fettleibigen Mäusen vorgesehen sind. Ein wichtiges Element dieser Analyse ist die Verwendung von Antikörpern, die zu tunfluoresziert nicht in Kanälen, in denen AT Makrophagen sind natürlich autofluoreszierenden, sowie die Verwendung der richtigen Kompensation Kontrollen.
Introduction
Historisch ist das Fettgewebe (AT) als inertes Organ Lipidspeicherung, die expandiert und kontrahiert in Reaktion auf Energiebilanz betrachtet. Wir verstehen jetzt, dass bei einem dynamischen endokrine Organ, das aktiv sondert eine Reihe von Hormonen, die direkten Einfluss auf das Fressverhalten und systemische Glukosehomöostase darstellt. Darüber hinaus in den letzten zehn Jahren hat es eine zunehmende Wertschätzung für die zahlreichen Populationen von Immunzellen mit Wohnsitz in der AT Stromazellen vaskulären Fraktion (SVF), sowie ihren Beitrag zur AT-Homöostase.
Die Fähigkeit, die AT Adipozyten und SVF Verwendung einer Kollagenase-Verdau trennen gefolgt durch differentielle Zentrifugation wurde zuerst von Rodbell 1964 1 beschrieben. Collagenase II wird am häufigsten für Adipozyten und SVF Trennung aufgrund von Wartungsarbeiten von Adipozyten Insulin-Rezeptoren 1 verwendet. Schon früh, enzymatische Fraktionierung von AT wurde in erster Linie eingesetzt, um adipo studierenCyte Stoffwechsel und Präadipozyten zu isolieren. In jüngerer Zeit hat diese Technik, mit der weit verbreiteten Verfügbarkeit von Durchflusszytometern und der ständig steigenden Anzahl von kommerziell erhältlichen fluorophorkonjugierten Antikörper kombiniert, die Charakterisierung von AT Immunzellen erleichtert.
Obwohl die Anwesenheit von Immunzellen im entzündeten AT hatte zuvor 2 beschrieben, die bahnbrechenden Arbeiten von Weisberg et al. und Xu et al. veröffentlicht im Jahr 2003 waren die ersten, die Anhäufung von AT Makrophagen (ATMs) in Fettleibigkeit, die inflammatorische Zytokine sezernieren und korrelieren mit AT-spezifische und systemische Insulinresistenz 3,4 dokumentieren. Diese Beobachtungen diente als Grundlage für ein neues Forschungsfeld vor kurzem geprägt, "immunometabolism", 5 und wurden von Studien implizieren verschiedene Immunzellen Bevölkerungsgruppen, einschließlich dendritischen Zellen 6, 7 Mastzellen, T-Zellen 8 gefolgt –10, B-Zellen 11, 12 NKT-Zellen, Eosinophile 13 und Neutrophilen 14,15 in der Entwicklung von Adipositas Insulinresistenz.
Das Ziel dieses Artikels ist es, eine detaillierte Beschreibung der Kollagenase Digest Technik verwendet, um Zellen des AT SVF zu isolieren und zu charakterisieren Geldautomaten und AT T-Zellen über Durchflusszytometrie bieten. Dieses Protokoll wurde für Maus optimiert wurde AT, aber die Zuschauer können von der Lektüre einen ausgezeichneten Artikel bieten umfangreiche Detail auf die Optimierung dieser Technik für den menschlichen AT 16 profitieren. Die Zielgruppe dieses Artikels enthält Ermittler mit begrenzter Erfahrung im Umgang mit Maus und AT Durchführung Durchflusszytometrie. Mehrere praktische Überlegungen zum Ausgleich zellulären Ertrag und Rentabilität mit Zeit und Ressourcen sowie eine optimale Durchflusszytometrie Kontrollen zur Charakterisierung AT Immunzellpopulationen vorgestellt. Zusätzlich zu unserem Protokoll werden die Leser referred einer aktuellen JoVE Artikel von Basu et al. für eine ausgezeichnete Diskussion über einige der technischen Aspekte der Durchflusszytometrie, um eine ordnungsgemäße Kontrollen und Kompensationen 17 umfassen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das zunehmende Interesse an der Rolle des Immunsystems in den metabolischen Konsequenzen der Adipositas hat die weit verbreitete Verwendung von Durchflusszytometrie, um Immunzellen des AT charakterisieren geführt. Obwohl die genaue Protokoll zwischen den Labors auf ihre eigene Erfahrung und die Ausstattung variieren, bezogen wird, sind die kritischen Schritte Kollagenaseverdau, differentielle Zentrifugation und Zelloberflächenantigen Kennzeichnung. Das Ziel des vorliegenden Artikels ist es, ein detailliertes Protokoll…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JSO durch ein NIH Ruth L. Kirschstein NRSA (F32 DK091040) unterstützt wird, ist AK durch ein Postdoc-Stipendium von der American Diabetes Association (7-10-MI-05) unterstützt und wird durch einen AHH American Heart Association Gegründet Investigator Awards unterstützt (12EIA8270000). Durchflusszytometrie Experimente wurden in der VMC Durchflusszytometrie Shared Resource durchgeführt. Der VMC Durchflusszytometrie Shared Resource wird von der Vanderbilt Digestive Disease Research Center (DK058404) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog # | |
| DPBS (no Ca or Mg) 10 x 500 ml | Life Technologies | 14190-250 | |
| DAPI | Life Technologies | D3571 | |
| BSA | Sigma | A2153-100G | |
| collagenase | Sigma | C6885-5G | |
| propidium iodide solution | Sigma | P4864-10 ml | |
| stable stack 20 microliter | Rainin | SS-L10 | |
| 20 microliter filter tips | Rainin | SRL10F | |
| stable stack 250 microliter tips | Rainin | SS-L250 | |
| 1000 microliter tips | Rainin | GPS-L1000 | |
| 1000 microliter filter tips | Rainin | GP-L1000F | |
| 250 microliter Filter Tips | Rainin | SR-L200F | |
| FC Block | BD Biosciences | 553142 | |
| fisher 100mn strainers | Fisherbrand | 22-363-549 | |
| medium weigh dish | Fisherbrand | 02-202B | |
| aluminum foil | Fisherbrand | 1213100 | |
| mincing scissors | Fisherbrand | 089531B | |
| Vortex | Fisherbrand | 2215365 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 14-959-49A | |
| filter top FACS tubes | BD Falcon | 352235 | |
| 10 ml pipette case 200 | BD Falcon | 1367520 | |
| round bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 5 ml syringe | BD Falcon | 309646 | |
| V Bottom Plates | Costar | 07-200-107 | |
| transfer bulb pipette | Thermo Scientific | 13-711-22 | |
| Shaker | Thermo Scientific | 11 676 071 | |
| Adhesive mat | Thermo Scientific | 1368750 | |
| Cell Culture Centrifuge | Sorvall | 75253839 | |
| Adapters | Sorvall | 75003723 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Concentration: 0.5 – 1 μg/ 106 cells |
| Rat anti-mouse F4/80 | eBioscience | 17-4801 | Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 17-4321 |
| Rat anti-mouse CD11b | eBioscience | 11-0112 | Fluorophore conjugate: FITC Concentration: 0.5 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 11/1/4031 |
| Armenian Hamster anti-mouse CD11c | eBioscience | 12-0114 | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: Dec-88 |
| Goat anti-mouse MGL1/2 | R&D Systems | FAB4297P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P |
| Goat anti-mouse CD206 | R&D Systems | FAB2535P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P |
| Rat anti-mouse CCR2 | R&D Systems | FAB5538P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC013P |
| Armenian Hamster anti-mouse TCRβ | BD Biosciences | 553174 | Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 553956 |
| Rat anti-mouse CD8a | BD Biosciences | 552877 | Fluorophore conjugate: PE-Cy7 Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 552784 |
| Rat anti-mouse CD4 | BD Biosciences | 557956 | Fluorophore conjugate: Alexa Fluor 700 Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 557963 |
Table 1. List of Materials and Reagents.
References
- Rodbell, M. Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis. The Journal of Biological Chemistry. 239, 375-380 (1964).
- Danse, L. H., Verschuren, P. M. Fish oil-induced yellow fat disease in rats. III. Lipolysis in affected adipose tissue. Veterinary Pathology. 15, 544-548 (1978).
- Weisberg, S. P., et al. Obesity is associated with macrophage accumulation in adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 112, 1796-1808 (2003).
- Xu, H., et al. Chronic inflammation in fat plays a crucial role in the development of obesity-related insulin resistance. The Journal of Clinical Investigation. 112, 1821-1830 (2003).
- Mathis, D., Shoelson, S. E. Immunometabolism: an emerging frontier. Nature Reviews. Immunology. 11, 81 (2011).
- Stefanovic-Racic, M., et al. Dendritic cells promote macrophage infiltration and comprise a substantial proportion of obesity-associated increases in CD11c+ cells in adipose tissue and liver. Diabetes. 61, 2330-2339 (2012).
- Liu, J., et al. Genetic deficiency and pharmacological stabilization of mast cells reduce diet-induced obesity and diabetes in mice. Nature Medicine. 15, 940-945 (2009).
- Feuerer, M., et al. Lean, but not obese, fat is enriched for a unique population of regulatory T cells that affect metabolic parameters. Nature Medicine. 15, 930-939 (2009).
- Nishimura, S., et al. CD8+ effector T cells contribute to macrophage recruitment and adipose tissue inflammation in obesity. Nature Medicine. 15, 914-920 (2009).
- Winer, S., et al. Normalization of obesity-associated insulin resistance through immunotherapy. Nature Medicine. 15, 921-929 (2009).
- Winer, D. A., et al. B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies. Nature Medicine. 17, 610-617 (2011).
- Wu, L., et al. Activation of invariant natural killer T cells by lipid excess promotes tissue inflammation, insulin resistance, and hepatic steatosis in obese mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109. , 1143-1152 (2012).
- Wu, D., et al. Eosinophils sustain adipose alternatively activated macrophages associated with glucose homeostasis. Science. 332, 243-247 (2011).
- Elgazar-Carmon, V., Rudich, A., Hadad, N., Levy, R. Neutrophils transiently infiltrate intra-abdominal fat early in the course of high-fat feeding. Journal of Lipid Research. 49, 1894-1903 (2008).
- Talukdar, S., et al. Neutrophils mediate insulin resistance in mice fed a high-fat diet through secreted elastase. Nature Medicine. 18, 1407-1412 (2012).
- Hagman, D. K., et al. Characterizing and quantifying leukocyte populations in human adipose tissue: impact of enzymatic tissue processing. Journal of Immunological Methods. 386, 50-59 (2012).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546 (2010).
- Kotecha, N., Krutzik, P. O., Irish, J. M. Web-based analysis and publication of flow cytometry experiments. Current Protocols in Cytometry. Chapter 10, Unit 10 (2010).
- Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circulation Research. 100, e47-e57 (2007).
- Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 45, 194-205 (2001).
