Isolering av fettvev immunceller

Summary

Fettvev (AT) er et område med intens immun celle aktivering og interaksjon. Nesten alle celler i immunsystemet er tilstede i AT og deres forhold er endret av fedme. Riktig isolasjon, kvantifisering, og karakterisering av AT immun celle populasjoner er avgjørende for å forstå sin rolle i immunometabolic sykdom.

Abstract

Oppdagelsen av økt makrofaginfiltrering i fettvev (AT) av overvektige gnagere og mennesker har ført til en intensivering av interesse i immunceller bidrag til lokal og systemisk insulinresistens. Isolering og kvantifisering av ulike immun celle populasjoner i mager og obese AT er nå en vanligvis benyttes teknikk i immunometabolism laboratorier, men ekstrem forsiktighet må tas både i stromal vaskulær celle isolasjon og i flowcytometri analyse, slik at data innhentet er pålitelig og tolkbare . I denne videoen viser vi hvordan du kjøttdeig, fordøye, og isolere immun celle-beriket stromal vaskulær brøk. Deretter viser vi hvordan du antistoff label makrofager og T-lymfocytter og hvordan du riktig gate på dem i flowcytometri eksperimenter. Representative flowcytometri plott fra lave fett-matet mager og høy fett-matet overvektige mus er gitt. Et kritisk element i denne analysen er bruk av antistoffer som gjørikke fluoresce i kanaler der AT makrofager er naturlig autofluorescent, samt bruk av riktig kompensasjon kontroller.

Introduction

Historisk har fettvev (AT) blitt sett på som en inert organ av lipid lagring, noe som utvider seg og trekker i respons til energibalansen. Nå forstår vi at AT representerer et dynamisk endokrine organ som aktivt utskiller en rekke hormoner, som direkte påvirker spiseatferd og systemisk glukose homeostase. I tillegg, det siste tiåret har det vært en økende forståelse for de mange bestander av immunceller bosatt i AT stromal vaskulær fraksjon (SVF), samt deres bidrag til AT homeostase.

Evnen til å skille AT adipocyte og SVF bruker en collagenase fordøye etterfulgt av differensial sentrifugering ble først beskrevet av Rodbell i 1964 ^en. Collagenase II er oftest brukt for adipocyte og SVF separasjon på grunn av vedlikehold av adipocyte insulin reseptorer ^en. Tidlig på, enzymatisk fraksjonering av AT ble primært brukt til å studere adipocyte metabolismen og å isolere preadipocytes. Mer nylig har denne teknikken, kombinert med den utbredte tilgjengeligheten av flowcytometere og den stadig økende antall kommersielt tilgjengelige fluorophore-konjugerte antistoffer, til rette for karakterisering av AT immunceller.

Selv om tilstedeværelsen av immunceller i betent på hadde vært beskrevet tidligere ^2, seminal artikler av Weisberg, et al. og Xu et al. publisert i 2003 var de første til å dokumentere opphopning av AT makrofager (minibanker) i fedme, som skiller inflammatoriske cytokiner og korrelerer med AT-spesifikke og systemisk insulinresistens ^3,4. Disse observasjonene tjente som grunnlag for et nytt felt med etterforskning nylig innførte, "immunometabolism," ⁵ og har blitt fulgt opp av studier implicating ulike immun celle populasjoner, inkludert dendrittiske celler ^6, mastceller ^7, T-celler ^{8 –}10, B-celler ^11, NKT celler ^12, eosinofile ^13, og nøytrofile ^14,15 i utviklingen av fedme assosiert insulinresistens.

Målet med denne artikkelen er å gi en detaljert beskrivelse av collagenase fordøye teknikk som brukes for å isolere celler av AT SVF og å karakterisere minibanker og ved T-celler via flow cytometri. Denne protokollen er optimalisert for mus AT, men kan seerne nytte av å lese en utmerket artikkel som gir omfattende detalj på optimalisering av denne teknikken for menneskelig AT ^16. Målgruppen for denne artikkelen omfatter etterforskere med begrenset erfaring med musen AT og utføre flowcytometri. Flere praktiske hensyn for å balansere mobilnettet yield og levedyktighet med tid og ressurser blir presentert samt optimale flowcytometri kontroller for å karakterisere AT immun celle populasjoner. I tillegg til protokollen vår, leserne er referred en fersk Jove artikkel av Basu et al. for en utmerket diskusjon av noen av de tekniske aspektene ved flowcytometri å inkludere forsvarlig kontroll og kompensasjoner ^17.

Protocol

En. Reagenser og rekvisita Før oppstart av denne eksperimentelle protokollen, forberede følgende reagenser: 70% etanol 1X PBS 1X DPBS (uten Ca og Mg) supplementert med 0,5% BSA FACS-buffer: 1X DPBS (uten Ca og Mg), 2 mM EDTA, og 1% FCS ACK-buffer: 150 mM NH4Cl, 10 mM 3 KHCO, og 0,1 mM Na EDTA i vann 2 2. Høsting og klargjøring av fettvev Avlive mus henhold til…

Representative Results

Collagenase fordøyelsen av AT etterfulgt av differensial sentrifugering ble brukt til å isolere SVF fra bitestiklenes fett pads av mannlige C57BL/6J mus matet en lav fett (10% kcal fra fett) eller høy fett (60% kcal fra fett) diett (LFD og HFD , henholdsvis) i 16 uker. Celler av den SVF ble deretter merket med fluorofor-konjugerte primære antistoffer for å kvantifisere andelen av levedyktige minibanker (figur 1), og ved T-celler (figur 2) via FACS analyse. Initial gating, inkludert…

Discussion

Økende interesse for rollen av immunsystemet i de metabolske konsekvensene av fedme har ført til utbredt bruk av flowcytometri å karakterisere immunceller i AT. Selv om den eksakte protokollen vil variere mellom laboratorier basert på egen erfaring og tilgjengelig utstyr, de kritiske trinnene omfatter collagenase fordøyelsen, differensial sentrifugering, og celleoverflateantigen merking. Målet med denne artikkelen er å gi en detaljert protokoll og praktisk guide for isolering av AT SVF til etterforskere med begre…

Materials

Name	Company	Catalog #
DPBS (no Ca or Mg) 10 x 500 ml	Life Technologies	14190-250
DAPI	Life Technologies	D3571
BSA	Sigma	A2153-100G
collagenase	Sigma	C6885-5G
propidium iodide solution	Sigma	P4864-10 ml
stable stack 20 microliter	Rainin	SS-L10
20 microliter filter tips	Rainin	SRL10F
stable stack 250 microliter tips	Rainin	SS-L250
1000 microliter tips	Rainin	GPS-L1000
1000 microliter filter tips	Rainin	GP-L1000F
250 microliter Filter Tips	Rainin	SR-L200F
FC Block	BD Biosciences	553142
fisher 100mn strainers	Fisherbrand	22-363-549
medium weigh dish	Fisherbrand	02-202B
aluminum foil	Fisherbrand	1213100
mincing scissors	Fisherbrand	089531B
Vortex	Fisherbrand	2215365
50 ml conical tubes	BD Falcon	14-959-49A
filter top FACS tubes	BD Falcon	352235
10 ml pipette case 200	BD Falcon	1367520
round bottom tubes	BD Falcon	352058
5 ml syringe	BD Falcon	309646
V Bottom Plates	Costar	07-200-107
transfer bulb pipette	Thermo Scientific	13-711-22
Shaker	Thermo Scientific	11 676 071
Adhesive mat	Thermo Scientific	1368750
Cell Culture Centrifuge	Sorvall	75253839
Adapters	Sorvall	75003723
Rat anti-mouse CD16/CD32	BD Biosciences	553142	Concentration: 0.5 – 1 μg/ 106 cells
Rat anti-mouse F4/80	eBioscience	17-4801	Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 17-4321
Rat anti-mouse CD11b	eBioscience	11-0112	Fluorophore conjugate: FITC Concentration: 0.5 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 11/1/4031
Armenian Hamster anti-mouse CD11c	eBioscience	12-0114	Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: Dec-88
Goat anti-mouse MGL1/2	R&D Systems	FAB4297P	Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P
Goat anti-mouse CD206	R&D Systems	FAB2535P	Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P
Rat anti-mouse CCR2	R&D Systems	FAB5538P	Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC013P
Armenian Hamster anti-mouse TCRβ	BD Biosciences	553174	Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 553956
Rat anti-mouse CD8a	BD Biosciences	552877	Fluorophore conjugate: PE-Cy7 Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 552784
Rat anti-mouse CD4	BD Biosciences	557956	Fluorophore conjugate: Alexa Fluor 700 Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 557963

Table 1. List of Materials and Reagents.