Aislamiento de tejido adiposo células inmunes
Summary
El tejido adiposo (AT) es un sitio de activación de células inmunes y la interacción intensa. Casi todas las células del sistema inmune están presentes en AT y sus proporciones se alteran por la obesidad. Aislamiento adecuado, cuantificación y caracterización de las poblaciones de células inmunes son fundamentales para la comprensión de su papel en la enfermedad immunometabolic.
Abstract
El descubrimiento de aumento de la infiltración de macrófagos en el tejido adiposo (AT) de los roedores y los seres humanos obesos ha dado lugar a una intensificación de interés en la contribución de células inmunes a la resistencia a la insulina local y sistémica. Aislamiento y cuantificación de diferentes poblaciones de células inmunes en magra y obesos AT es ahora una técnica comúnmente utilizada en los laboratorios immunometabolism; todavía extrema se debe tener cuidado tanto en el aislamiento de células del estroma vascular y en el análisis de citometría de flujo, de modo que los datos obtenidos es fiable e interpretables . En este video se demuestra cómo pica, digerir, y aislar la fracción vascular estromal enriquecida con células inmunes. A continuación, mostramos cómo los macrófagos etiqueta de anticuerpos y los linfocitos T y la forma de la puerta correctamente en los experimentos de citometría de flujo. Se proporcionan flujo representativos parcelas citometría de bajos magras y grasa de alto ratones obesos alimentados con grasa alimentados. Un elemento crítico de este análisis es el uso de anticuerpos que hacenno fluorescencia en los canales donde AT macrófagos son naturalmente autofluorescente, así como el uso de los controles de compensación adecuados.
Introduction
Históricamente, el tejido adiposo (AT) ha sido considerada como un órgano inerte de almacenamiento de lípidos, que se expande y contrae en respuesta al balance energético. Ahora entendemos que AT representa un órgano endocrino que segrega dinámica activamente una serie de hormonas, que influyen directamente en el comportamiento de alimentación y sistémicos homeostasis de la glucosa. Además, durante la última década ha habido un reconocimiento creciente de los numerosos poblaciones de células inmunes residentes en el AT fracción del estroma vascular (SVF), así como su contribución a la homeostasis de AT.
La capacidad de separar la AT adipocitos y SVF usando una colagenasa digestión seguido de centrifugación diferencial fue descrito por primera vez por Rodbell en 1964 1. Colagenasa II es la más utilizada para la separación de los adipocitos y SVF debido al mantenimiento de los receptores de insulina adipocitos 1. Desde el principio, el fraccionamiento enzimático de AT fue empleado principalmente para estudiar AdipoCYTE metabolismo y aislar preadipocitos. Más recientemente, esta técnica, combinada con la disponibilidad generalizada de citómetros de flujo y el cada vez mayor número de anticuerpos conjugados con fluoróforo disponibles comercialmente, ha facilitado la caracterización de AT células inmunes.
Aunque la presencia de células inmunes en inflamado AT había sido descrito previamente 2, los papeles seminales por Weisberg et al. y Xu et al. publicado en 2003 fueron los primeros en documentar la acumulación de macrófagos AT (cajeros automáticos) de la obesidad, que secretan citoquinas inflamatorias y se correlaciona con AT-específica y la resistencia a la insulina sistémica 3,4. Estas observaciones sirven como la base de un nuevo campo de investigación acuñado recientemente, "immunometabolism," 5 y han sido objeto de seguimiento por estudios que implican diversas poblaciones de células inmunes, incluyendo células dendríticas 6, mastocitos, células T 7 8 –10, 11 las células B, células NKT 12, 13, eosinófilos y neutrófilos 14,15 en el desarrollo de la obesidad resistencia a la insulina asociada.
El objetivo de este artículo es proporcionar una descripción detallada de la técnica de digestión de colagenasa utilizado para aislar las células de la AT SVF y para caracterizar los cajeros automáticos y AT células T a través de citometría de flujo. Este protocolo ha sido optimizado para ratón AT, sin embargo, los espectadores pueden beneficiarse de la lectura de un artículo excelente que proporciona una descripción más detallada en la optimización de esta técnica para el consumo humano a los 16 años. El público objetivo de este artículo incluye investigadores con poca experiencia de trabajo con el ratón AT y la realización de citometría de flujo. Varias consideraciones prácticas para equilibrar el rendimiento y la viabilidad celular con el tiempo y los recursos se presentan, así como controles de citometría de flujo óptimas para la caracterización de las poblaciones de células inmunes. Además de nuestro protocolo, los lectores son referred a un reciente artículo de Jove por Basu et al. para una excelente discusión sobre algunos de los aspectos técnicos de la citometría de flujo para incluir controles adecuados y compensaciones 17.
Protocol
Representative Results
Discussion
El creciente interés en el papel del sistema inmune en las consecuencias metabólicas de la obesidad ha llevado al uso generalizado de citometría de flujo para caracterizar las células inmunes de la AT. Aunque el protocolo exacto varía entre los laboratorios en base a su propia experiencia y los equipos disponibles, los pasos críticos incluyen la digestión colagenasa, centrifugación diferencial, y la superficie de la célula etiquetado antígeno. El objetivo del presente artículo es proporcionar un protocolo det…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JSO se apoya en un NIH Ruth L. Kirschstein NRSA (F32 DK091040), Alaska con el apoyo de una beca posdoctoral de la Asociación Americana de Diabetes (7-10-MI-05), y AHH se apoya en un American Heart Association Fundada Investigator Award (12EIA8270000). Experimentos de citometría de flujo se realizaron en el Flujo VMC Citometría de recursos compartidos. El VMC Citometría de flujo de recursos compartidos con el apoyo del Centro de Investigación de Enfermedades Digestivas Vanderbilt (DK058404).
Materials
| Name | Company | Catalog # | |
| DPBS (no Ca or Mg) 10 x 500 ml | Life Technologies | 14190-250 | |
| DAPI | Life Technologies | D3571 | |
| BSA | Sigma | A2153-100G | |
| collagenase | Sigma | C6885-5G | |
| propidium iodide solution | Sigma | P4864-10 ml | |
| stable stack 20 microliter | Rainin | SS-L10 | |
| 20 microliter filter tips | Rainin | SRL10F | |
| stable stack 250 microliter tips | Rainin | SS-L250 | |
| 1000 microliter tips | Rainin | GPS-L1000 | |
| 1000 microliter filter tips | Rainin | GP-L1000F | |
| 250 microliter Filter Tips | Rainin | SR-L200F | |
| FC Block | BD Biosciences | 553142 | |
| fisher 100mn strainers | Fisherbrand | 22-363-549 | |
| medium weigh dish | Fisherbrand | 02-202B | |
| aluminum foil | Fisherbrand | 1213100 | |
| mincing scissors | Fisherbrand | 089531B | |
| Vortex | Fisherbrand | 2215365 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 14-959-49A | |
| filter top FACS tubes | BD Falcon | 352235 | |
| 10 ml pipette case 200 | BD Falcon | 1367520 | |
| round bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 5 ml syringe | BD Falcon | 309646 | |
| V Bottom Plates | Costar | 07-200-107 | |
| transfer bulb pipette | Thermo Scientific | 13-711-22 | |
| Shaker | Thermo Scientific | 11 676 071 | |
| Adhesive mat | Thermo Scientific | 1368750 | |
| Cell Culture Centrifuge | Sorvall | 75253839 | |
| Adapters | Sorvall | 75003723 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Concentration: 0.5 – 1 μg/ 106 cells |
| Rat anti-mouse F4/80 | eBioscience | 17-4801 | Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 17-4321 |
| Rat anti-mouse CD11b | eBioscience | 11-0112 | Fluorophore conjugate: FITC Concentration: 0.5 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 11/1/4031 |
| Armenian Hamster anti-mouse CD11c | eBioscience | 12-0114 | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: Dec-88 |
| Goat anti-mouse MGL1/2 | R&D Systems | FAB4297P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P |
| Goat anti-mouse CD206 | R&D Systems | FAB2535P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P |
| Rat anti-mouse CCR2 | R&D Systems | FAB5538P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC013P |
| Armenian Hamster anti-mouse TCRβ | BD Biosciences | 553174 | Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 553956 |
| Rat anti-mouse CD8a | BD Biosciences | 552877 | Fluorophore conjugate: PE-Cy7 Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 552784 |
| Rat anti-mouse CD4 | BD Biosciences | 557956 | Fluorophore conjugate: Alexa Fluor 700 Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 557963 |
Table 1. List of Materials and Reagents.
References
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- Weisberg, S. P., et al. Obesity is associated with macrophage accumulation in adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 112, 1796-1808 (2003).
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