مجموع استخراج بروتين و 2-D طرق جل الكهربائي ل<em> بيركولديريا</em> الأنواع
Summary
أعضاء من جنس بيركولديريا هي مسببات الأمراض ذات الأهمية السريرية. نحن تصف طريقة لاستخراج البروتين الكلي البكتيري، وذلك باستخدام اضطراب الميكانيكية، و 2-D الكهربائي للهلام لتحليل البروتين اللاحقة.
Abstract
التحقيق في مستويات البروتين داخل الخلايا من الأنواع البكتيرية من الأهمية لفهم الآليات المسببة للأمراض من الأمراض التي تسببها هذه الكائنات. نحن هنا وصف الإجراء لاستخراج البروتين من الأنواع بيركولديريا على أساس تحلل الميكانيكية باستخدام الخرز الزجاجي في وجود حمض tetraacetic الإيثيلين وphenylmethylsulfonyl الفلوريد في الفوسفات مخزنة المالحة. هذه الطريقة يمكن استخدامها لأنواع مختلفة بيركولديريا، لظروف النمو المختلفة، وانها مناسبة المحتمل للاستخدام في الدراسات البروتين من البكتيريا الأخرى. بعد استخراج البروتين، ويوصف (2-D) هلام الكهربائي تقنية البروتين ثنائي الأبعاد لدراسة التغيرات العالمية في proteomes من هذه الكائنات. يتكون هذا الأسلوب من فصل البروتينات وفقا لجهة نظرهم كهرساوي بواسطة كهرساوي التركيز في البعد الأول، تليها الفصل على أساس الوزن الجزيئيبواسطة الأكريلاميد هلام الكهربائي في البعد الثاني. ويتم فصل التصور من البروتينات بها الفضة تلطيخ.
Introduction
تضم بيركولديريا جنس أكثر من 62 نوعا، والكائنات السلبية الغرام معزولة عن مجموعة واسعة من المنافذ، ويتم تقسيمها في مجموعتين رئيسيتين 1،2. وتشمل المجموعة الأولى phytotrophic الكائنات البشرية والحيوانية و، وركزت معظم الدراسات على الأنواع المسببة للأمراض من هذه المجموعة نظرا لأهميتها السريرية الخاصة بهم. الأعضاء الأكثر الممرضة هي B. الراعومية وباء. المطرقة (الذي يسبب راعوم والرعام على التوالي) 3،4 ومسببات الأمراض الانتهازية (17 أنواع محددة من مجمع الشرهة بيركولديريا، BCC) 5، والتي تسبب المرض في التليف الكيسي (CF) والداء الحبيبي المزمن (CGD) 1. المجموعة الثانية، مع أكثر من 30 نوعا غير إمراضية، وتشمل البكتيريا المرتبطة النباتات أو مع البيئة، وتعتبر قد تكون مفيدة إلى المضيف 2.
مضاعفات عديدة تظهر الابعدوى بكتيرية ام مع أعضاء المسببة للأمراض من جنس بيركولديريا، مثل نقل مسببات المرض بين المرضى، وانتشار المرض وفشل العلاج بسبب المقاومة الذاتية أو المكتسبة للمضادات الحيوية مما يجعل من الصعب للقضاء في معظم الحالات 6-9. لذا، والحصول على فهم أوضح لأساس لإنشاء عدوى بكتيرية أمر حيوي لعلاج الأمراض التي تسببها هذه الكائنات. من أجل الحصول على نظرة ثاقبة إنشاء العدوى، وهناك حاجة إلى إجراء تحقيقات واسعة النطاق على المكونات البكتيرية المرتبطة المرضية. وصف الدراسات التي تركز على تحليل البروتين من الكائنات الحية بيركولديريا باستخدام نهج البروتين البروتينات التي قد تورطت في المرضية البكتيرية وكذلك التغيرات في بروتيوم بهم لمحات 10-16.
طرق استخراج البروتين باستخدام صوتنة ودورات إذابة تجميد في تحلل العازلة التي تحتوي اضرب عاليةentration من اليوريا، وقد تم تطبيق ثيوريا في تركيبة مع المنظفات وampholytes في بيركولديريا الدراسات البروتين 10-13. على الرغم من اليوريا هي فعالة جدا للبروتين تمسخ، فإنه يمكن إقامة التوازن في محلول مائي مع الإيزوسيانات الأمونيوم، والتي يمكن أن تتفاعل مع مجموعات من الأحماض الأمينية، وبالتالي تشكيل التحف (carbamylation رد فعل) 17. وبالتالي، فمن المستحسن أن تشمل ampholytes الناقل، والتي تكون بمثابة الزبالين سيانات وتجنب درجات الحرارة فوق 37 درجة مئوية 17. علاوة على ذلك، لمنع أي تدخل الكيميائي للتحلل العازلة مع البروتين الكمي، وهو نفس العازلة تحلل يمكن استخدامها لتوليد منحنى القياسية بحيث العينات والمعايير لديهم نفس الخلفية 10. تنطوي منهجيات أخرى استخدام مخازن القلوية والمنظفات مع فترات الحضانة حرارة 17،18، ولكن هذه الظروف قد تحدث تغييرات في بروتيوم وبعض المنظفات غير متوافقة مع العلاقات العامةتطبيق oteomics ما لم يتم تضمين الخطوات اللاحقة إزالة المنظفات 17،18.
بعد استخراج والكمي كافية، والتعبير البروتين العالمي لكل فرد البروتين يمكن دراستها باستخدام نهج البروتين مثل ثنائي الأبعاد (2-D) هلام الكهربائي. وقد وصفت هذه التقنية أول مرة من قبل O'Farell 19 وتتكون في فصل البروتينات وفقا لجهة نظرهم كهرساوي بواسطة كهرساوي التركيز في البعد الأول، ومن ثم وفقا لوزنهم الجزيئي بواسطة مادة الأكريلاميد هلام الكهربائي في البعد الثاني. بسبب قرارها والحساسية، وهذا الأسلوب هو أداة قوية لتحليل والكشف عن البروتينات من مصادر بيولوجية معقدة 19،20. هذه التقنية الانفصال هو متاح حاليا في النهج التي تركز البروتين مع ميزة كبيرة في حل الأشكال الإسوية البروتين الناجمة عن التعديلات بعد النسخي أو تجهيز بروتين. التغيرات الكميةويمكن الكشف عن طريق مقارنة شدة البقعة المقابلة بعد تلطيخ من هلام 20. ومع ذلك، لا تناسب هذه التقنية لتحديد البروتينات كبيرة جدا، والبروتينات الغشاء، والبروتينات الأساسية للغاية والحمضية أو مسعور، وتقنية شاقة وتستغرق وقتا طويلا إلى حد ما 20. النهج الببتيد مركزية جديدة (بناء هلام غير) التي هي أكثر قوة وموضوعية تصبح متاحة ويمكن استخدامها للمقارنة الكمي بالطرق وضع العلامات النظائر مستقرة التفاضلية مثل وضع العلامات السيستين من قبل تلوينها نظير تقارب الجغرافية (ICAT) 21، والمجموعة الأمينية وضع العلامات النظائر الجغرافية لتحديد الكميات النسبية والمطلقة (iTRAQ) 22. استخدام تقنية البروتين واحد قد يعطي معلومات كافية، وبالتالي استخدام نهجين البروتين التكميلية ضروري لمعظم التغييرات تقييم كامل في بروتيوم. ومع ذلك، يتم استخدام على نطاق واسع 2-D الكهربائي للهلام ويمكن تطبيقها بشكل روتيني لتشيوانالكمي المنجز التعبير عن العديد من البروتينات في الكائنات الحية المختلفة.
نحن هنا وصف استخراج البروتين خلية كاملة و 2-D إجراءات هلام الكهربائي عن الأنواع التي تم تكييفها بيركولديريا والأمثل من الرعاية الصحية GE 2-D المبادئ الكهربائي وطرق كتيب 80-6429-60AC عام 2004 ( www.amershambiosciences.com ). تم تنفيذ استخراج البروتين من استخدام الخافق حبة مع الخرز الزجاجي في وجود برنامج تلفزيوني يحتوي على 5 ملي EDTA (الإيثيلين حمض tetraacetic) و 1 ملي PMSF (phenylmethylsulfonyl الفلورايد). يسمح هذا الإجراء الكمي للبروتينات مع الحد الأدنى من التدهور وغير قابلة للتعديل لنهج البروتين كما ذكرت سابقا 15،23،24. تم تنفيذ 2-D الكهربائي للهلام خارج باستخدام 24 سم يجمد طويلة درجة الحموضة 4-7 التدرج وتم فصل البروتينات وفقا لجهة نظرهم كهرساوي. ثم تم فصل البروتينات وفقا لmolec بهمالوزن جزيئية بواسطة هلام SDS-بولكرلميد. بالإضافة إلى ذلك، وصفنا طريقة الفضة تلطيخ لرؤية البروتينات بقعة، وطريقة وصمة عار الفضة والتي تتوافق لتحليل الطيف الكتلي. معا هذه الإجراءات يمكن أن تسمح بتحديد البروتينات الهامة من الأنواع بيركولديريا التي يمكن أن تشارك في التسبب.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد وصفت طريقة لتحضير البروتينات التي يمكن استخراج معظم البروتينات بيركولديريا مع استنساخ جيدة. ويتجلى ذلك من خلال الحصول على نفس التشكيل الجانبي البروتين من اثنين الاستعدادات مستقلة أجريت في أيام مختلفة باستخدام نفس الثقافة البكتيرية التي تزرع في مرق LB أو YEM ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل studentship من جامعة كولومبيا البريطانية (لBV) والمنح المقدمة من التليف الكيسي كندا والكندية معاهد أبحاث الصحة (لDPS). نشكر جاكلين تشونغ لإعداد الأولي من البروتوكولات.
Materials
| Reagents | |||
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | Toxic, corrosive |
| Acetone | Fisher | A18-1 | Flammable |
| PBS Buffer | Bioscience | R028 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher | BP118-500 | toxic |
| Glass beads (0.1 mm) | BioSpec Products | 11079101 | |
| Nalgene Oak Ridge Centrifuge tubes, polycarbonate (50 ml) | VWR | 21009-342 | |
| MicroBCA protein extraction kit | Pierce | 23235 | |
| Microcentrifuge Tubes 2.0 ml conical Screw cap Tubes with Cap and O-Ring | Fisher | 02-681-375 | |
| 2-D Clean-Up kit | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| Urea | Invitrogen | 15505-050 | Irritant |
| CHAPS | Amersham Biosciences | 17-1314-01 | |
| Dithiothreitol (DTT) | MPBiomedical, LCC | 856126 | Irritant |
| Immobiline DryStrips pH 4-7 24 cm | Amersham Biosciences | 176002-46 | |
| Duracryl | Proteomic Solutions | 80-0148 | Very toxic, carcinogen |
| Ammonium persulfate | Fisher | BP179-100 | Flammable, toxic, corrosive |
| N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) | Invitrogen | 15524-010 | Flammable |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-500 | Acute toxicity, flammable |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| Ethanol | Fisher | HC1100-1GL | Flammable, toxic |
| Acetic acid | Fisher | A491-212 | Flammable, corrosive |
| Glutaraldehyde | Fisher | G151-1 | Very toxic, corrosive, dangerous for the environment |
| Potassium tetrathionate | Sigma | P2926 | Irritant |
| Sodium acetate | EM Science | 7510 | |
| Silver nitrate | Sigma | 209139 | Corrosive, dangerous for the environment |
| Formaldehyde | Sigma | 252549 | Toxic |
| Sodium thiosulfate | Sigma | S7026 | |
| Tris Base | EMD | 9230 | |
| Glycine | MPBiomedical, LCC | 808831 | |
| Glycerol | MPBiomedical, LCC | 800688 | |
| Methanol | Fisher | A412-4 | Flammable, toxic, health hazard |
| Sodium carbonate anhydrous | EMD | SX0400-3 | Toxic |
| Mineral oil | ACROS | 415080010 | |
| Equipment | |||
| JA-20 ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | 334831 | |
| Mini Beadbeater | Biospec Products | 3110BX | |
| Ettan IPGphor II Isoelectric Focusing System and accessories | GE Healthcare | 80-6505-03 | www.amershambiosciences.com |
| Ettan DALT Large Vertical electrophoresis system | GE Healthcare | 80-6485-27 | www.amershambiosciences.com |
References
- Drevinek, P., Mahenthiralingam, E. Burkholderia cenocepacia in cystic fibrosis: epidemiology and molecular mechanisms of virulence. Clin. Microbiol. Infect. 16, 821-830 (2010).
- Suarez-Moreno, Z. R., et al. Common Features of Environmental and Potentially Beneficial Plant-Associated Burkholderia. Microb. Ecol. , (2011).
- Wiersinga, W. J., van der Poll, T., White, N. J., Day, N. P., Peacock, S. J. Melioidosis: insights into the pathogenicity of Burkholderia pseudomallei. Nat. Rev. Microbiol. 4, 272-282 (2006).
- White, N. J. Melioidosis. Lancet. 361, 1715-1722 (2003).
- Mahenthiralingam, E., Urban, T. A., Goldberg, J. B. The multifarious, multireplicon Burkholderia cepacia complex. Nat. Rev. Microbiol. 3, 144-156 (2005).
- Speert, D. P., Henry, D., Vandamme, P., Corey, M., Mahenthiralingam, E. Epidemiology of Burkholderia cepacia complex in patients with cystic fibrosis. Canada. Emerg. Infect. Dis. 8, 181-187 (2002).
- Dance, D. A., Wuthiekanun, V., Chaowagul, W., White, N. J. The antimicrobial susceptibility of Pseudomonas pseudomallei. Emergence of resistance in vitro and during treatment. J. Antimicrob. Chemother. 24, 295-309 (1989).
- Thibault, F. M., Hernandez, E., Vidal, D. R., Girardet, M., Cavallo, J. D. Antibiotic susceptibility of 65 isolates of Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei to 35 antimicrobial agents. J. Antimicrob. Chemother. 54, 1134-1138 (2004).
- Govan, J. R. W., et al. Evidence for transmission of Pseudomonas cepacia by social contact in cystic fibrosis. Lancet. 342, 15-19 (1993).
- Thongboonkerd, V., et al. Altered proteome in Burkholderia pseudomallei rpoE operon knockout mutant: insights into mechanisms of rpoE operon in stress tolerance, survival, and virulence. J. Proteome. Res. 6, 1334-1341 (2007).
- Park, K. H., Lipuma, J. J., Lubman, D. M. Comparative proteomic analysis of B. cenocepacia using two-dimensional liquid separations coupled with mass spectrometry. Anal Chim. Acta. 592, 91-100 (2007).
- Wongtrakoongate, P., Mongkoldhumrongkul, N., Chaijan, S., Kamchonwongpaisan, S., Tungpradabkul, S. Comparative proteomic profiles and the potential markers between Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis. Mol. Cell Probes. 21, 81-91 (2007).
- Harding, S. V., et al. The identification of surface proteins of Burkholderia pseudomallei. Vaccine. 25, 2664-2672 (2007).
- Madeira, A., Santos, P. M., Coutinho, C. P., Pinto-de-Oliveira, A., Sa-Correia, I. Quantitative proteomics (2-D DIGE) reveals molecular strategies employed by Burkholderia cenocepacia to adapt to the airways of cystic fibrosis patients under antimicrobial therapy. Proteomics. 11, 1313-1328 (2011).
- Zlosnik, J. E. A., Speert, D. P. The Role of Mucoidy in Virulence of Bacteria from the Burkholderia cepacia Complex: A Systematic Proteomic and Transcriptomic Analysis. J. Infect. Dis. 202, 770-781 (2010).
- Riedel, K., Carranza, P., Gehrig, P., Potthast, F., Eberl, L. Towards the proteome of Burkholderia cenocepacia H111: setting up a 2-DE reference map. Proteomics. 6, 207-216 (2006).
- Weiss, W., Gorg, A. Sample solublization buffers for two-dimensional electrophoresis. Methods Mol. Biol. 424, 35-42 (2008).
- von der Haar, T. Optimized protein extraction for quantitative proteomics of yeasts. PLoS One. 2, e1078 (2007).
- O’Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250, 4007-4021 (1975).
- Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics. 4, 3665-3685 (2004).
- Gygi, S. P., Rist, B., Griffin, T. J., Eng, J., Aebersold, R. Proteome analysis of low-abundance proteins using multidimensional chromatography and isotope-coded affinity tags. J. Proteome Res. 1, 47-54 (2002).
- Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol. Cell Proteomics. 3, 1154-1169 (2004).
- Velapatiño, B., Limmathurotsakul, D., Peacock, S. J., Speert, D. P. Identification of differentially expressed proteins from Burkholderia pseudomallei isolated during primary and relapsing melioidosis. Microbes. Infect. 14, 335-340 (2012).
- Chung, J. W., Speert, D. P. Proteomic identification and characterization of bacterial factors associated with Burkholderia cenocepacia survival in a murine host. Microbiology. 153, 206-214 (2007).
- Rotz, L. D., Khan, A. S., Lillibridge, S. R., Ostroff, S. M., Hughes, J. M. Public health assessment of potential biological terrorism agents. Emerg. Infect. Dis. 8, 225-230 (2002).
- Thon, J. N., et al. Comprehensive proteomic analysis of protein changes during platelet storage requires complementary proteomic approaches. Transfusion. 48, 425-435 (2008).
- Wu, T. In New and Emerging Proteomic Techniques. Methods Mol. Biol. 328, 71-95 (2006).
- Lopez, M. F., et al. A comparison of silver stain and SYPRO Ruby Protein Gel Stain with respect to protein detection in two-dimensional gels and identification by peptide mass profiling. Electrophoresis. 21, 3673-3683 (2000).
