Gesamtproteinextraktion und 2-D Gelelektrophorese-Methoden für<em> Burkholderia</em> Arten
Summary
Mitglieder der Gattung Burkholderia sind Erreger von klinischer Bedeutung. Wir beschreiben ein Verfahren zur bakteriellen Gesamtproteinextraktion unter Verwendung mechanischer Aufbruch-und 2-D-Gelelektrophorese für nachfolgende Proteomanalyse.
Abstract
Die Untersuchung der intrazellulären Proteinspiegel von Bakterienarten von Bedeutung für das Verständnis der pathogenen Mechanismen von Krankheiten, die durch diese Organismen verursacht werden. Hier beschreiben wir ein Verfahren für die Proteinextraktion aus Burkholderia-Arten, basierend auf mechanischen Lysis mit Glaskügelchen in Gegenwart von Ethylendiamintetraessigsäure und Phenylmethylsulfonylfluorid in phosphatgepufferter Salzlösung. Dieses Verfahren kann für verschiedene Burkholderia-Arten verwendet werden, für die verschiedenen Wachstumsbedingungen, und es ist wahrscheinlich für die Verwendung in proteomischen Untersuchungen von anderen Bakterien. Nach Proteinextraktion wird eine zweidimensionale (2-D) Gelelektrophorese Proteom Technik beschrieben, um globale Veränderungen im Proteom dieser Organismen zu studieren. Dieses Verfahren besteht aus der Trennung von Proteinen entsprechend ihrem isoelektrischen Punktes durch isoelektrische Fokussierung in der ersten Dimension, gefolgt von der Trennung auf der Basis des Molekulargewichtsdurch Acrylamid-Gel-Elektrophorese in der zweiten Dimension. Visualisierung der getrennten Proteine wird durch Silberfärbung durchgeführt.
Introduction
Die Gattung Burkholderia umfasst mehr als 62 Arten, Gram-negative Organismen aus einer Vielzahl von Nischen isoliert, und es ist in zwei Hauptcluster 1,2 unterteilt ist. Der erste Cluster umfasst menschliche, tierische und phytotrophic Organismen, und die meisten Studien haben sich auf die pathogenen Arten dieser Gruppe aufgrund ihrer klinischen Bedeutung konzentriert. Die meisten Mitglieder sind pathogene B. pseudomallei und B. mallei (die Melioidose Rotz und bewirkt, dass jeweils) 3,4 und opportunistische Infektionen (die 17 Arten der Burkholderia cepacia-Komplex, BCC) 5, die Krankheit bei zystischer Fibrose (CF) und chronische Granulomatose (CGD) führen ein. Der zweite Cluster mit mehr als 30 nicht-pathogenen Spezies enthält Bakterien mit Pflanzen oder mit der Umgebung verbunden und werden als potentiell nützlich, um den Host-2.
Zahlreiche Komplikationen entstehen from bakterielle Infektion mit dem pathogenen Mitgliedern der Gattung Burkholderia, wie die Übertragung des Erregers zwischen Patienten, Ausbreitung der Krankheit und Therapieversagen wegen der intrinsischen oder erworbene Resistenz gegenüber Antibiotika schwer zu machen in den meisten Fällen 6-9 beseitigen. Daher gewinnt ein besseres Verständnis der Grundlagen zur Erstellung von bakteriellen Infektion ist entscheidend für die Behandlung von Krankheiten, die durch diese Organismen verursacht werden. Um Einblick in die Etablierung der Infektion zu gewinnen, sind umfangreiche Untersuchungen der bakteriellen Komponenten mit Pathogenese verbunden nötig. Studien mit Schwerpunkt auf der Proteom-Analyse von Burkholderia Organismen unter Verwendung Proteom-Ansätzen beschriebenen Proteine, die in bakteriellen Pathogenese impliziert worden sind sowie Veränderungen in ihrem Proteom-Profile 10-16.
Protein-Extraktionsverfahren mit Ultraschall und gefrieraufgetaut Zyklen in Lyse-Puffer mit hoher konzentration Harnstoff, Thioharnstoff ist in Kombination mit Reinigungsmittel und Ampholyte in Burkholderia proteomische Studien 10-13 angewendet. Obwohl Harnstoff ist sehr effizient für die Denaturierung von Proteinen, kann es ein Gleichgewicht in wässriger Lösung mit Ammonium Isocyanat, die mit Amino-Gruppen reagieren können, zu schaffen, wodurch Artefakte (Carbamylierung Reaktion) 17. Daher ist es empfehlenswert, Trägerampholyten, die als Radikalfänger wirken, umfassen Cyanat und vermeiden Sie Temperaturen über 37 ° C 17. Weiterhin jede chemische Störungen Lysepuffer mit Proteinquantifizierung zu verhindern, können die gleichen Lyse-Puffer verwendet, um die Standardkurve zu erzeugen, so dass die Proben und die Standards, die gleiche Hintergrund 10 werden. Andere Methoden beinhalten die Verwendung von alkalischen Puffer-und Reinigungsmittel mit Wärme Inkubationszeiten 17,18, aber diese Bedingungen könnten Veränderungen im Proteom induzieren und einige Reinigungsmittel sind nicht kompatibel mit proteomics Anwendung, es sei denn anschließenden Reinigungsausbauschritte enthalten 17,18.
Nach ausreichender Extraktion und Quantifizierung können globale Proteinexpression jedes einzelnen Proteins unter Verwendung Proteomics wie zweidimensionale (2-D) Gelelektrophorese untersucht werden. Diese Technik wurde zuerst von O'Farell 19 beschrieben und besteht in der Trennung von Proteinen entsprechend ihrem isoelektrischen Punktes durch isoelektrische Fokussierung in der ersten Dimension, und dann nach ihrem Molekulargewicht durch Acrylamid-Gel-Elektrophorese in der zweiten Dimension. Aufgrund der Auflösung und Empfindlichkeit, ist diese Technik ein mächtiges Werkzeug für die Analyse und Detektion von Proteinen aus komplexen biologischen Quellen 19,20. Dieses Trennverfahren ist in Protein-zentrierte Ansätze mit dem großen Vorteil zur Lösung von Protein-Isoformen durch posttranskriptionelle Modifikationen oder proteolytische Verarbeitung verursacht verfügbar. Quantitative Veränderungenkann durch Vergleich der Intensität des entsprechenden Punkt nach Färbung des Gels 20 detektiert werden. Jedoch ist diese Technik nicht für die Ermittlung von sehr großen Proteine, Membranproteine extrem basischen und sauren oder hydrophoben Proteine geeignet, und ist etwas mühsam und zeitaufwendige Technik 20. Neue Peptid-zentrierten Ansätzen (nicht Gel-Basis), die robuster und Ziel sind verfügbar und können zur quantitativen Vergleich von Differential stabilen Isotopenmarkierungsmethoden wie Cystein Kennzeichnung von isotopencodierten Affinität Tagging (ICAT) 21, und Amino-Gruppe verwendet werden Kennzeichnung von Isotop-Tagging für relative und absolute Quantifizierung (iTRAQ) 22. Die Verwendung eines einzigen Proteom Technik könnte nicht genügend Informationen erhalten, so dass die Verwendung von zwei komplementären Proteomics notwendig ist für die meisten vollständig Beurteilung von Veränderungen im Proteom. Dennoch ist 2-D-Gelelektrophorese verbreiteten und routinemäßig für Mengen angewendet werdentive Expression mehrerer Proteine in verschiedenen Organismen.
Hier beschreiben wir eine Ganzzellproteinextraktion und 2-D-Gelelektrophorese Verfahren für Burkholderia Spezies, die angepasst und optimiert wurden aus den GE Healthcare 2-D-Elektrophorese-Grundlagen und Methoden-Handbuch 80-6429 60AC-2004 ( www.amershambiosciences.com ). Die Proteingewinnung wurde mit einer Kugelmühle mit Glasperlen in Gegenwart von PBS mit 5 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) und 1 mM PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) durchgeführt. Dieses Verfahren ermöglicht die Quantifizierung von Proteinen mit minimalen Abbau und änderbare für proteomische Ansätze wie bereits berichtet 15,23,24. 2-D-Gelelektrophorese wurde unter Verwendung von 24 cm immobilisierte pH-Gradienten von 4-7 und Proteinen durchgeführt wurden entsprechend ihrem isoelektrischen Punkt abgetrennt. Proteine wurden dann entsprechend ihrer Mole getrenntdere Gewicht durch SDS-Polyacrylamid-Gel. Außerdem beschrieben wir eine Silberfärbung Verfahren zur Visualisierung von Punkt Proteinen und einer Silberfärbung Methode, die für die Massenspektrometrie-Analyse kompatibel ist. Zusammen können diese Verfahren die Identifizierung von wichtigen Proteinen aus Burkholderia-Arten, die in der Pathogenese beteiligt sein könnten ermöglichen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Verfahren zur Herstellung Proteinen wurde beschrieben, dass die Mehrzahl von Burkholderia Proteine mit guter Reproduzierbarkeit zu extrahieren. Dies wird durch Erhalten der gleichen Proteinprofil von zwei unabhängigen Präparaten in unterschiedlichen Tagen unter Verwendung des gleichen Bakterienkultur in LB-Brühe oder YEM wie in Fig. 1 gezeigt, durchgeführt gezeigt. Extraktion war effizient für Bakterien in Flüssigmedien gewachsen, allerdings haben wir diese Methode nicht getestet f?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium von der University of British Columbia (BV) und Zuschüsse von Mukoviszidose Kanada und Canadian Institutes of Health Research (DPS) unterstützt. Wir danken Jacqueline Chung für die erste Erstellung von Protokollen.
Materials
| Reagents | |||
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | Toxic, corrosive |
| Acetone | Fisher | A18-1 | Flammable |
| PBS Buffer | Bioscience | R028 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher | BP118-500 | toxic |
| Glass beads (0.1 mm) | BioSpec Products | 11079101 | |
| Nalgene Oak Ridge Centrifuge tubes, polycarbonate (50 ml) | VWR | 21009-342 | |
| MicroBCA protein extraction kit | Pierce | 23235 | |
| Microcentrifuge Tubes 2.0 ml conical Screw cap Tubes with Cap and O-Ring | Fisher | 02-681-375 | |
| 2-D Clean-Up kit | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| Urea | Invitrogen | 15505-050 | Irritant |
| CHAPS | Amersham Biosciences | 17-1314-01 | |
| Dithiothreitol (DTT) | MPBiomedical, LCC | 856126 | Irritant |
| Immobiline DryStrips pH 4-7 24 cm | Amersham Biosciences | 176002-46 | |
| Duracryl | Proteomic Solutions | 80-0148 | Very toxic, carcinogen |
| Ammonium persulfate | Fisher | BP179-100 | Flammable, toxic, corrosive |
| N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) | Invitrogen | 15524-010 | Flammable |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-500 | Acute toxicity, flammable |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| Ethanol | Fisher | HC1100-1GL | Flammable, toxic |
| Acetic acid | Fisher | A491-212 | Flammable, corrosive |
| Glutaraldehyde | Fisher | G151-1 | Very toxic, corrosive, dangerous for the environment |
| Potassium tetrathionate | Sigma | P2926 | Irritant |
| Sodium acetate | EM Science | 7510 | |
| Silver nitrate | Sigma | 209139 | Corrosive, dangerous for the environment |
| Formaldehyde | Sigma | 252549 | Toxic |
| Sodium thiosulfate | Sigma | S7026 | |
| Tris Base | EMD | 9230 | |
| Glycine | MPBiomedical, LCC | 808831 | |
| Glycerol | MPBiomedical, LCC | 800688 | |
| Methanol | Fisher | A412-4 | Flammable, toxic, health hazard |
| Sodium carbonate anhydrous | EMD | SX0400-3 | Toxic |
| Mineral oil | ACROS | 415080010 | |
| Equipment | |||
| JA-20 ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | 334831 | |
| Mini Beadbeater | Biospec Products | 3110BX | |
| Ettan IPGphor II Isoelectric Focusing System and accessories | GE Healthcare | 80-6505-03 | www.amershambiosciences.com |
| Ettan DALT Large Vertical electrophoresis system | GE Healthcare | 80-6485-27 | www.amershambiosciences.com |
References
- Drevinek, P., Mahenthiralingam, E. Burkholderia cenocepacia in cystic fibrosis: epidemiology and molecular mechanisms of virulence. Clin. Microbiol. Infect. 16, 821-830 (2010).
- Suarez-Moreno, Z. R., et al. Common Features of Environmental and Potentially Beneficial Plant-Associated Burkholderia. Microb. Ecol. , (2011).
- Wiersinga, W. J., van der Poll, T., White, N. J., Day, N. P., Peacock, S. J. Melioidosis: insights into the pathogenicity of Burkholderia pseudomallei. Nat. Rev. Microbiol. 4, 272-282 (2006).
- White, N. J. Melioidosis. Lancet. 361, 1715-1722 (2003).
- Mahenthiralingam, E., Urban, T. A., Goldberg, J. B. The multifarious, multireplicon Burkholderia cepacia complex. Nat. Rev. Microbiol. 3, 144-156 (2005).
- Speert, D. P., Henry, D., Vandamme, P., Corey, M., Mahenthiralingam, E. Epidemiology of Burkholderia cepacia complex in patients with cystic fibrosis. Canada. Emerg. Infect. Dis. 8, 181-187 (2002).
- Dance, D. A., Wuthiekanun, V., Chaowagul, W., White, N. J. The antimicrobial susceptibility of Pseudomonas pseudomallei. Emergence of resistance in vitro and during treatment. J. Antimicrob. Chemother. 24, 295-309 (1989).
- Thibault, F. M., Hernandez, E., Vidal, D. R., Girardet, M., Cavallo, J. D. Antibiotic susceptibility of 65 isolates of Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei to 35 antimicrobial agents. J. Antimicrob. Chemother. 54, 1134-1138 (2004).
- Govan, J. R. W., et al. Evidence for transmission of Pseudomonas cepacia by social contact in cystic fibrosis. Lancet. 342, 15-19 (1993).
- Thongboonkerd, V., et al. Altered proteome in Burkholderia pseudomallei rpoE operon knockout mutant: insights into mechanisms of rpoE operon in stress tolerance, survival, and virulence. J. Proteome. Res. 6, 1334-1341 (2007).
- Park, K. H., Lipuma, J. J., Lubman, D. M. Comparative proteomic analysis of B. cenocepacia using two-dimensional liquid separations coupled with mass spectrometry. Anal Chim. Acta. 592, 91-100 (2007).
- Wongtrakoongate, P., Mongkoldhumrongkul, N., Chaijan, S., Kamchonwongpaisan, S., Tungpradabkul, S. Comparative proteomic profiles and the potential markers between Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis. Mol. Cell Probes. 21, 81-91 (2007).
- Harding, S. V., et al. The identification of surface proteins of Burkholderia pseudomallei. Vaccine. 25, 2664-2672 (2007).
- Madeira, A., Santos, P. M., Coutinho, C. P., Pinto-de-Oliveira, A., Sa-Correia, I. Quantitative proteomics (2-D DIGE) reveals molecular strategies employed by Burkholderia cenocepacia to adapt to the airways of cystic fibrosis patients under antimicrobial therapy. Proteomics. 11, 1313-1328 (2011).
- Zlosnik, J. E. A., Speert, D. P. The Role of Mucoidy in Virulence of Bacteria from the Burkholderia cepacia Complex: A Systematic Proteomic and Transcriptomic Analysis. J. Infect. Dis. 202, 770-781 (2010).
- Riedel, K., Carranza, P., Gehrig, P., Potthast, F., Eberl, L. Towards the proteome of Burkholderia cenocepacia H111: setting up a 2-DE reference map. Proteomics. 6, 207-216 (2006).
- Weiss, W., Gorg, A. Sample solublization buffers for two-dimensional electrophoresis. Methods Mol. Biol. 424, 35-42 (2008).
- von der Haar, T. Optimized protein extraction for quantitative proteomics of yeasts. PLoS One. 2, e1078 (2007).
- O’Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250, 4007-4021 (1975).
- Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics. 4, 3665-3685 (2004).
- Gygi, S. P., Rist, B., Griffin, T. J., Eng, J., Aebersold, R. Proteome analysis of low-abundance proteins using multidimensional chromatography and isotope-coded affinity tags. J. Proteome Res. 1, 47-54 (2002).
- Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol. Cell Proteomics. 3, 1154-1169 (2004).
- Velapatiño, B., Limmathurotsakul, D., Peacock, S. J., Speert, D. P. Identification of differentially expressed proteins from Burkholderia pseudomallei isolated during primary and relapsing melioidosis. Microbes. Infect. 14, 335-340 (2012).
- Chung, J. W., Speert, D. P. Proteomic identification and characterization of bacterial factors associated with Burkholderia cenocepacia survival in a murine host. Microbiology. 153, 206-214 (2007).
- Rotz, L. D., Khan, A. S., Lillibridge, S. R., Ostroff, S. M., Hughes, J. M. Public health assessment of potential biological terrorism agents. Emerg. Infect. Dis. 8, 225-230 (2002).
- Thon, J. N., et al. Comprehensive proteomic analysis of protein changes during platelet storage requires complementary proteomic approaches. Transfusion. 48, 425-435 (2008).
- Wu, T. In New and Emerging Proteomic Techniques. Methods Mol. Biol. 328, 71-95 (2006).
- Lopez, M. F., et al. A comparison of silver stain and SYPRO Ruby Protein Gel Stain with respect to protein detection in two-dimensional gels and identification by peptide mass profiling. Electrophoresis. 21, 3673-3683 (2000).
