Totale Estrazione di proteine e 2-D elettroforesi su gel Metodi per<em> Burkholderia</em> Specie
Summary
I membri del genere Burkholderia sono patogeni di importanza clinica. Noi descriviamo un metodo per l'estrazione delle proteine totali batterica, utilizzando distruzione meccanica, e elettroforesi su gel 2-D per la successiva analisi proteomica.
Abstract
L'indagine dei livelli di proteine intracellulari di specie batteriche è importante per comprendere i meccanismi patogenetici delle malattie causate da questi organismi. Qui si descrive un procedimento per l'estrazione di proteine da specie Burkholderia basato su lisi meccanica utilizzando perle di vetro in presenza di acido etilendiamminotetraacetico e fluoruro phenylmethylsulfonyl in tampone fosfato salino. Questo metodo può essere utilizzato per diverse specie di Burkholderia, per diverse condizioni di crescita, ed è probabile adatto per l'uso in studi di proteomica di altri batteri. Dopo l'estrazione di proteine, una bidimensionale (2-D) elettroforesi su gel tecnica proteomica è descritta per studiare i cambiamenti globali nei proteoma di questi organismi. Questo metodo consiste nella separazione delle proteine in base al loro punto isoelettrico mediante focalizzazione isoelettrica nella prima dimensione, seguita da separazione sulla base del peso molecolaremediante elettroforesi su gel di acrilammide nella seconda dimensione. Visualizzazione di proteine separate avviene tramite colorazione argentica.
Introduction
Il Burkholderia genere comprende più di 62 specie, microrganismi Gram-negativi isolati da una vasta gamma di nicchie, ed è diviso in due gruppi principali 1,2. Il primo cluster comprende umana, animale e gli organismi phytotrophic, e la maggior parte degli studi si sono concentrati sulle specie patogene di questo gruppo a causa della loro importanza clinica. I membri più patogeni sono B. pseudomallei e B. mallei (che provoca rispettivamente melioidosi e morva) 3,4 e patogeni opportunisti (le 17 specie definite del complesso Burkholderia cepacia, BCC) 5, che causano la malattia della fibrosi cistica (CF) e malattia granulomatosa cronica (CGD) 1. Il secondo gruppo, con più di 30 specie patogene, comprende batteri associati con le piante o con l'ambiente, e sono considerati potenzialmente benefico per l'host 2.
Numerose complicazioni emergono frinfezione batterica om con i membri patogeni del genere Burkholderia, come la trasmissione del patogeno tra pazienti, diffusione della malattia e fallimento del trattamento a causa della resistenza intrinseca o acquisita agli antibiotici rendendo difficile sradicare nella maggior parte dei casi 6-9. Pertanto, ottenendo una migliore comprensione della base per l'istituzione di infezione batterica è fondamentale per il trattamento di malattie causate da questi organismi. Al fine di ottenere una visione nello stabilimento di infezione, sono necessarie approfondite indagini sui componenti batterici associati alla patogenesi. Studi incentrati sull'analisi proteomica di organismi Burkholderia utilizzando approcci di proteomica descritti proteine che sono stati implicati nella patogenesi batterica così come i cambiamenti nel loro proteoma PROFILI 10-16.
Metodi di estrazione di proteine mediante sonicazione e cicli di gelo-scongelati in tampone di lisi contenente alta concentration di urea, tiourea in combinazione con detergente e anfoliti è stato applicato in Burkholderia studi di proteomica 10-13. Anche se l'urea è molto efficace per denaturazione proteica, può stabilire un equilibrio in soluzione acquosa con isocianato di ammonio, che può reagire con gruppi ammino acidi, formando così artefatti (reazione carbamilazione) 17. Pertanto, si raccomanda di includere anfoliti portanti, che agiscono come spazzini cianato ed evitare temperature superiori a 37 ° C 17. Inoltre, per evitare qualsiasi interferenza chimica di tampone di lisi con proteine quantificazione, lo stesso tampone di lisi può essere utilizzato per generare la curva standard in modo che i campioni e gli standard hanno lo stesso sfondo 10. Altre metodologie prevedono l'utilizzo di tamponi alcalini e detergenti con calore periodi di incubazione 17,18, ma tali condizioni potrebbero inducono cambiamenti nel proteoma e alcuni detersivi non sono compatibili con proteomics domanda, salvo successive fasi di rimozione del detersivo sono inclusi 17,18.
Dopo estrazione e quantificazione adeguata, espressione proteica globale di ogni singola proteina può essere studiata utilizzando approcci di proteomica come bidimensionale (2-D) elettroforesi su gel. Questa tecnica è stata descritta da O'Farell 19 e consiste nella separazione delle proteine in base al loro punto isoelettrico mediante focalizzazione isoelettrica nella prima dimensione, e poi in base al loro peso molecolare mediante elettroforesi su gel di acrilammide nella seconda dimensione. Grazie alla sua risoluzione e sensibilità, questa tecnica è un potente strumento per l'analisi e la rilevazione di proteine da fonti biologiche complesse 19,20. Questa tecnica di separazione è attualmente disponibile negli approcci proteina-centric, con il grande vantaggio di risolvere isoforme della proteina causate da modificazioni post-trascrizionali o proteolitici processing. Variazioni quantitativepuò essere rilevato confrontando l'intensità del corrispondente punto dopo colorazione del gel 20. Tuttavia, questa tecnica non è adatta per l'identificazione di molto grandi proteine, proteine di membrana, proteine estremamente semplice e acidi o idrofobi, ed è un po 'laborioso e richiede tempo tecnica 20. Nuovi approcci peptide-centric (basato su gel non) che sono più robusti e oggettivo diventano disponibili e possono essere utilizzati per il confronto quantitativo da differenziali metodi di etichettatura isotopo stabile come l'etichettatura cisteina per affinità isotopo codificato tagging (ICAT) 21, e il gruppo amminico etichettatura da isotopo codifica per la quantificazione relativa e assoluta (iTRAQ) 22. L'uso di una singola tecnica proteomica potrebbe dare informazioni sufficienti, pertanto è necessario l'utilizzo di due approcci di proteomica complementari per la maggior parte dei cambiamenti pienamente valutare in proteoma. Tuttavia, 2-D elettroforesi su gel è ampiamente utilizzato e può essere applicato routine per quantitativo espressione di diverse proteine in organismi differenti.
Qui si descrive una estrazione di proteine whole-cell e 2-D le procedure di elettroforesi su gel per le specie di Burkholderia che sono stati adattati e ottimizzati da GE Healthcare 2-D elettroforesi Principi e metodi Handbook 80-6429-60AC 2004 ( www.amershambiosciences.com ). L'estrazione delle proteine è stata effettuata utilizzando un battitore branello con perle di vetro in presenza di PBS contenente 5 mM di EDTA (etilendiammina tetraacetico) e 1 mM PMSF (fluoruro phenylmethylsulfonyl). Questa procedura permette la quantificazione delle proteine con degradazione minima ed è modificabile per gli approcci di proteomica come precedentemente riportato 15,23,24. 2-D gel elettroforesi è stata effettuata usando 24 centimetri lungo immobilizzati pH 4-7 sfumate e proteine sono state separate in base al loro punto isoelettrico. Poi proteine sono state separate in base alla loro molecpeso colare da gel SDS-poliacrilammide. Inoltre, abbiamo descritto un metodo di colorazione argento per la visualizzazione di proteine piatte e un metodo macchia d'argento che è compatibile per analisi di spettrometria di massa. Insieme, queste procedure possono consentire l'identificazione di proteine importanti specie di Burkholderia che potrebbero essere coinvolti nella patogenesi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Procedimento per la preparazione di proteine è stato descritto che può estrarre la maggior parte delle proteine Burkholderia con buona riproducibilità. Ciò è dimostrato ottenendo lo stesso profilo proteico da due preparazioni indipendenti eseguiti in giorni diversi utilizzando la stessa coltura batterica cresciuta in LB o YEM brodo come mostrato nella Figura 1. Estrazione era efficiente per i batteri coltivati in terreni liquidi, ma non abbiamo testato questo metodo per i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio presso l'Università della British Columbia (a BV) e borse di Cystic Fibrosis Canada e Canadian Institutes of Health Research (a DPS). Ringraziamo Jacqueline Chung per la preparazione iniziale dei protocolli.
Materials
| Reagents | |||
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | Toxic, corrosive |
| Acetone | Fisher | A18-1 | Flammable |
| PBS Buffer | Bioscience | R028 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher | BP118-500 | toxic |
| Glass beads (0.1 mm) | BioSpec Products | 11079101 | |
| Nalgene Oak Ridge Centrifuge tubes, polycarbonate (50 ml) | VWR | 21009-342 | |
| MicroBCA protein extraction kit | Pierce | 23235 | |
| Microcentrifuge Tubes 2.0 ml conical Screw cap Tubes with Cap and O-Ring | Fisher | 02-681-375 | |
| 2-D Clean-Up kit | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| Urea | Invitrogen | 15505-050 | Irritant |
| CHAPS | Amersham Biosciences | 17-1314-01 | |
| Dithiothreitol (DTT) | MPBiomedical, LCC | 856126 | Irritant |
| Immobiline DryStrips pH 4-7 24 cm | Amersham Biosciences | 176002-46 | |
| Duracryl | Proteomic Solutions | 80-0148 | Very toxic, carcinogen |
| Ammonium persulfate | Fisher | BP179-100 | Flammable, toxic, corrosive |
| N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) | Invitrogen | 15524-010 | Flammable |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-500 | Acute toxicity, flammable |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| Ethanol | Fisher | HC1100-1GL | Flammable, toxic |
| Acetic acid | Fisher | A491-212 | Flammable, corrosive |
| Glutaraldehyde | Fisher | G151-1 | Very toxic, corrosive, dangerous for the environment |
| Potassium tetrathionate | Sigma | P2926 | Irritant |
| Sodium acetate | EM Science | 7510 | |
| Silver nitrate | Sigma | 209139 | Corrosive, dangerous for the environment |
| Formaldehyde | Sigma | 252549 | Toxic |
| Sodium thiosulfate | Sigma | S7026 | |
| Tris Base | EMD | 9230 | |
| Glycine | MPBiomedical, LCC | 808831 | |
| Glycerol | MPBiomedical, LCC | 800688 | |
| Methanol | Fisher | A412-4 | Flammable, toxic, health hazard |
| Sodium carbonate anhydrous | EMD | SX0400-3 | Toxic |
| Mineral oil | ACROS | 415080010 | |
| Equipment | |||
| JA-20 ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | 334831 | |
| Mini Beadbeater | Biospec Products | 3110BX | |
| Ettan IPGphor II Isoelectric Focusing System and accessories | GE Healthcare | 80-6505-03 | www.amershambiosciences.com |
| Ettan DALT Large Vertical electrophoresis system | GE Healthcare | 80-6485-27 | www.amershambiosciences.com |
References
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