We beschrijven de manier van programmeren stamcellen therapeutische angiogenese factoren overexpressie bioafbreekbare polymere nanodeeltjes. Beschreven processen omvatten polymeersynthese, transfecteren vet-afgeleide stamcellen in vitro, en valideren van de werkzaamheid van geprogrammeerde stamcellen om angiogenese te bevorderen in een muizen achterbeen ischemie model.
Gecontroleerde vasculaire groei is cruciaal voor een succesvolle weefselregeneratie en wondgenezing, alsmede voor de behandeling van ischemische ziekten zoals beroerte, hartaanval of perifere arteriële aandoeningen. Directe levering van angiogene groeifactoren heeft het potentieel om groei van nieuwe bloedvaten te stimuleren, maar wordt vaak geassocieerd met beperkingen zoals gebrek aan targeting en korte halfwaardetijd in vivo. Gentherapie biedt een andere kijk door het leveren van genen die coderen voor angiogene factoren, maar vereist vaak met behulp van virus, en wordt beperkt door bezorgdheid over de veiligheid. Hier beschrijven we een recent ontwikkelde strategie voor het bevorderen van vasculaire groei door het programmeren stamcellen angiogene factoren overexpressie in situ gebruik van biologisch afbreekbare polymere nanodeeltjes. Specifiek onze strategie gebruikt stamcellen bestelwagens door te profiteren van hun vermogen om te migreren naar ischemische weefsels in vivo. De geoptimaliseerde polymère vectoren, vet-afgeleidestamcellen werden gewijzigd om een angiogene gen dat vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) overexpressie. We beschreven werkwijzen voor de polymere synthese, vorming van het nanodeeltje transfectie stamcellen in vitro, alsook werkwijzen voor het valideren van de werkzaamheid van VEGF expressie stamcellen voor het bevorderen van angiogenese in muizen achterbeen ischemie model.
Het algemene doel van deze techniek is om therapeutische angiogenese met niet-viraal geprogrammeerde stamcellen overexpressie therapeutische factoren op de plaats van ischemie. Stamcellen werden gewijzigd ex vivo eerste gebruik van biologisch afbreekbare nanodeeltjes gesynthetiseerd in het lab, en vervolgens getransplanteerd in een muizenmodel van achterbeen ischemie om hun potentieel te valideren voor het verbeteren van angiogenese en weefsel berging.
Gecontroleerde vasculaire groei een belangrijk onderdeel van succesvolle weefselregeneratie, en voor behandeling van verschillende ziekten zoals ischemische beroerte, ischemie en myocardiaal infarct. Verscheidene strategieën zijn ontwikkeld om vasculaire groei, inclusief groeifactor productietijd en celtherapie te bevorderen. 1 Ondanks de werkzaamheid waargenomen in de dierlijke ziektemodellen, deze werkwijzen ondervinden nog steeds beperkingen, zoals de noodzaak van suprafysiologische doses groeifactor levering of onvoldoende paracrinevrijgeven cellen alleen. Een mogelijke strategie om de bovenstaande beperkingen te overwinnen is om stamcellen en gentherapie, waarbij stamcellen genetisch geprogrammeerd ex vivo voorafgaand aan transplantatie om gewenste therapeutische factoren overexpressie te combineren. Deze aanpak is aangetoond in diverse modellen, waaronder de ziekte van achterbeen ischemie 2, hart-en vaatziekten 3, botgenezing 4 en neurale verwonding 5, enz. De meeste gentherapietechnieken afhankelijk virale vectoren, die worden geassocieerd met veiligheidsproblemen als potentiële immunogeniciteit en insertie mutagenese. Biomaterialen gemedieerde non-virale gentherapie kunnen deze beperkingen te overwinnen, maar vaak last van lage transfectie-efficiëntie. Om het tempo van de ontdekking van nieuwe biomaterialen voor efficiënte niet-virale gentherapie, hebben recente studies combinatorische chemie en high-throughput screening aanpak toegepast. Biologisch afbreekbaar polymeer bibliotheken zoals poly (β-amino esters) (PBAE) ontwikkeld en gescreend, wat leidde tot de ontdekking van leidende polymeren met sterk verbeterde transfectie-efficiëntie in vergelijking met de conventionele vector polymere tegenhangers. 6-7
Hierin beschrijven we de synthese van PBAE en verificatie van hun vermogen om vet-afgeleide stamcellen (ADSCs) transfecteren in vitro, gevolgd door daaropvolgende transplantatie van genetisch gemodificeerde ADSCs overexpressie vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) in een muizenmodel van ischemie achterbeen . De uitkomsten werden geëvalueerd door het bijhouden lot van de cel met behulp van bioluminescentie beeldvorming, het beoordelen van weefsel reperfusie met behulp van laser Doppler perfusie beeldvorming (LDPI), en het bepalen van angiogenese en weefsel berging door histologie.
Hier melden wij een methode om volwassen stamcellen programmeren therapeutische factoren overexpressie behulp van niet-virale, biologisch afbreekbare nanodeeltjes. Dit platform is bijzonder bruikbaar voor het behandelen van ziekten waarbij stamcellen kan natuurlijk huis, zoals ischemie en kanker. 9-10 In de non-virale gentherapie platform biedt voor transiënte overexpressie van therapeutische factoren, die geschikt is voor de meeste weefselregeneratie en wond genezingsproces. De transfectie proces afhankelij…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen graag American Heart Association Nationale Scientist Development Grant (10SDG2600001), Stanford Bio-X Interdisciplinair Initiative Program, en Stanford Medical Scholars Research Program erkennen voor financiering.
Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
DMEM | Invitrogen | 11965 | |
Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10082 | |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15070 | |
Basic Fibroblast Growth Factor | Peprotech | 100-18B | |
1,4-Butanediol Diacrylate (90%) | Sigma Aldrich | 411744 | Acronym: C |
5-amino-1-pentanol (97%) | Alfa Aesar | 2508-29-4 | Acronym: 32 |
Tetraethyleneglycoldiamine >99%) | Molecular Biosciences | 17774 | Acronym: 122 |
Sodium Acetate | G-Biosciences | R010 | |
Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 14190-144 | |
Tetrahyofuran Anhydrous (>99.9%) | Sigma Aldrich | 401757 | |
Diethyl Ether Anhydrous (>99%) | Fisher Scientific | E138-4 | |
DMSO Anhydrous (>99.9%) | Sigma Aldrich | 276855 | |
Gelatin | Sigma Aldrich | G9391 | |
Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200 | |
D-luciferin | GoldBio | ||
Optimal Cutting Temperature (O.C.T) | Tissue-Tek | 4583 | |
Rat anti-Mouse CD31 | BD Pharmingen | 550274 | |
Alexa Fluor 594 anti-rat IgG | Invitrogen | A11007 |