Les cellules souches de programmation pour angiogenèse thérapeutique utilisant polymère biodégradable nanoparticules
Summary
Nous décrivons la méthode des cellules souches de programmation pour surexprimer des facteurs thérapeutiques pour l'angiogenèse en utilisant des nanoparticules polymériques biodégradables. Les procédés décrits comprennent la synthèse du polymère, la transfection de cellules souches du tissu adipeux in vitro, et de valider l'efficacité des cellules souches programmées pour favoriser l'angiogenèse dans un modèle d'ischémie des membres postérieurs de souris.
Abstract
La croissance vasculaire contrôlée, est critique pour la régénération des tissus et la cicatrisation des plaies avec succès, ainsi que pour le traitement de maladies ischémiques telles que l'accident vasculaire cérébral, infarctus du myocarde ou les maladies artérielles périphériques. La livraison directe des facteurs de croissance angiogéniques a le potentiel de stimuler la croissance de nouveaux vaisseaux sanguins, mais est souvent associée à des limitations telles que le manque de ciblage et la courte demi-vie in vivo. La thérapie génique offre une approche alternative par la délivrance de gènes codant pour des facteurs angiogéniques, mais nécessite souvent l'aide de virus, et est limitée par des préoccupations de sécurité. Nous décrivons ici une stratégie récemment mis au point pour la stimulation de la croissance vasculaire par les cellules souches de programmation pour surexprimer des facteurs angiogéniques in situ en utilisant des nanoparticules polymériques biodégradables. Plus précisément notre stratégie utilisée cellules souches comme des véhicules de délivrance, en profitant de leur capacité à migrer vers les tissus ischémiques in vivo. En utilisant les vecteurs polymères optimisés, adipeux dérivésLes cellules souches ont été modifiées pour surexprimer un gène codant pour le facteur angiogénique de croissance endothélial vasculaire (VEGF). Nous avons décrit les procédés pour la synthèse du polymère, la formation des nanoparticules, la transfection de cellules souches in vitro, ainsi que des procédés pour la validation de l'efficacité des cellules souches exprimant VEGF pour la promotion de l'angiogenèse dans un modèle d'ischémie des membres postérieurs de souris.
Introduction
L'objectif global de cette technique est de promouvoir l'angiogenèse thérapeutique utilisant des cellules souches non-virale programmées surexprimant facteurs thérapeutiques au site de l'ischémie. Les cellules souches ont été modifiées ex vivo en utilisant d'abord des nanoparticules biodégradables synthétisés dans le laboratoire, et ensuite transplantées dans un modèle murin de la patte arrière ischémie pour valider leur potentiel de développement de l'angiogenèse et de sauvetage de tissu.
La croissance vasculaire contrôlée, est un composant important de la régénération des tissus succès, ainsi que pour le traitement de diverses maladies ischémiques telles que l'accident vasculaire cérébral, une ischémie des membres, et l'infarctus du myocarde. Plusieurs stratégies ont été développées pour favoriser la croissance vasculaire, y compris la fourniture d'un facteur de croissance et de la thérapie à base de cellules. Une Malgré l'efficacité observée dans les modèles de maladies animales, ces procédés font toujours face à des limitations telles que la nécessité de doses supra-physiologiques pour la livraison d'un facteur de croissance, ou insuffisante paracrinelibérer de cellules seules. Une stratégie possible pour surmonter les limitations ci-dessus est de combiner la thérapie des cellules souches et la thérapie génique, par laquelle les cellules souches sont programmés génétiquement ex vivo avant la transplantation de surexprimer facteurs thérapeutiques souhaitables. Cette approche a été démontrée dans divers modèles de maladies, y compris des membres postérieurs ischémie 2, les maladies du cœur 3, la cicatrisation osseuse 4 et 5 lésion neurologique, etc. Cependant, la plupart des techniques de thérapie génique s'appuient sur des vecteurs viraux, qui sont associés à des problèmes de sécurité tels que l'immunogénicité potentielle et la mutagenèse insertionnelle. Biomatériaux médiation livraison de gène non viral peuvent surmonter ces limitations, mais souffrent souvent de faible efficacité de la transfection. Pour accélérer la découverte de nouveaux biomatériaux pour la livraison de gène non viral efficace, des études récentes ont utilisé la chimie combinatoire et de l'approche de criblage à haut débit. Bibliothèques de polymères biodégradables tels que le poly (es β-aminotres) (PBAE) ont été développés et masquées, ce qui a conduit à la découverte des principaux polymères avec nettement amélioré l'efficacité de la transfection par rapport aux produits traditionnels de vecteurs polymères. 6-7
Nous décrivons ici la synthèse de PBAE et la vérification de leur aptitude à transfecter des cellules souches du tissu adipeux (ADSC) in vitro, suivie d'une greffe ultérieure de ADSC génétiquement modifiées surexprimant le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) dans un modèle murin de membre postérieur ischémie . Les résultats ont été évalués par le suivi le destin des cellules en utilisant l'imagerie par bioluminescence, l'évaluation de la reperfusion tissulaire en utilisant laser Doppler imagerie de perfusion (LDPI), et la détermination de l'angiogenèse et de tissus de récupération par l'histologie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous rapportons ici une méthode pour programmer des cellules souches adultes pour surexprimer facteurs thérapeutiques utilisant non viraux, des nanoparticules biodégradables. Cette plate-forme est particulièrement utile pour le traitement de maladies où les cellules souches peuvent naturellement à la maison, tels que l'ischémie et du cancer. 10.9 En outre, le non-viral plate-forme de délivrance de gène permet la surexpression transitoire de facteurs thérapeutiques, ce qui convient pour la plupar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier l'American Heart Association nationale de subvention au développement scientifique (10SDG2600001), X Bio-programme Stanford interdisciplinaire Initiative, et de recherche de Stanford chercheurs médicaux de financement.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| DMEM | Invitrogen | 11965 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10082 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15070 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Peprotech | 100-18B | |
| 1,4-Butanediol Diacrylate (90%) | Sigma Aldrich | 411744 | Acronym: C |
| 5-amino-1-pentanol (97%) | Alfa Aesar | 2508-29-4 | Acronym: 32 |
| Tetraethyleneglycoldiamine >99%) | Molecular Biosciences | 17774 | Acronym: 122 |
| Sodium Acetate | G-Biosciences | R010 | |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 14190-144 | |
| Tetrahyofuran Anhydrous (>99.9%) | Sigma Aldrich | 401757 | |
| Diethyl Ether Anhydrous (>99%) | Fisher Scientific | E138-4 | |
| DMSO Anhydrous (>99.9%) | Sigma Aldrich | 276855 | |
| Gelatin | Sigma Aldrich | G9391 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200 | |
| D-luciferin | GoldBio | ||
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T) | Tissue-Tek | 4583 | |
| Rat anti-Mouse CD31 | BD Pharmingen | 550274 | |
| Alexa Fluor 594 anti-rat IgG | Invitrogen | A11007 |
References
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