Programmering stamceller for Therapeutic Angiogenese Bruke biologisk nedbrytbart Polymer Nanopartikler

Summary

Vi beskriver en fremgangsmåte for programmering stamceller til økt ekspresjon av terapeutiske forhold for angiogenese ved bruk av biologisk nedbrytbare polymere nanopartikler. Prosessene som beskrives omfatter polymer-syntese, transfeksjon adipose-avledede stamceller in vitro, og validere effekten av programmerte stamceller for å fremme angiogenese i et murint bakben ischemia modell.

Abstract

Kontrollert vaskulær vekst er kritisk for vellykket vevsregenerering og sårheling, samt for behandling av ischemiske sykdommer, slik som slag, hjerteinfarkt eller perifere arterielle sykdommer. Direkte levering av angiogene vekstfaktorer har potensial til å stimulere ny vekst blodkar, men er ofte forbundet med begrensninger som mangel på kort halveringstid in vivo målretting og. Genterapi tilbyr en alternativ tilnærming ved å levere gener som koder angiogenetiske faktorer, men ofte krever bruk av virus, og er begrenset av sikkerhetsmessige hensyn. Her beskriver vi en nylig utviklet strategi for å stimulere vaskulær vekst ved programmering stamceller til økt ekspresjon angiogenetiske faktorer in situ ved hjelp av biologisk nedbrytbare polymere nanopartikler. Spesielt vår strategi benyttet stamceller som levering kjøretøy ved å dra nytte av deres evne til å migrere mot iskemiske vev in vivo. Bruke den optimaliserte polymere vektorer, adipose-avledetstamceller ble modifisert for å overuttrykker en angiogen gen som koder for vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF). Vi har beskrevet prosesser for polymer-syntese, nanopartikkel formasjon, transfeksjon stamceller in vitro, så vel som fremgangsmåter for å validere effekten av VEGF-uttrykkende stamceller for å fremme angiogenese i et murint bakben ischemia modell.

Introduction

Det overordnede målet med denne teknikken er å fremme terapeutisk angiogenese ved hjelp av ikke-viralt programmerte stamceller overekspresjon terapeutiske faktorer på stedet av iskemi. Stamceller ble endret ex vivo første bruker biologisk nedbrytbare nanopartikler syntetisert i laboratoriet, og deretter transplantert i en murine modell av bakben iskemi å validere sitt potensial for å styrke angiogenese og vev berging.

Kontrollert vaskulær vekst er en viktig komponent i vellykket regenerering av vev, så vel som for behandling av forskjellige ischemiske sykdommer, slik som slag, ischemi, og myokardialt infarkt. Flere strategier er blitt utviklet for å fremme vaskulær vekst, inkludert vekstfaktor levering og cellebasert terapi. ^1. Til tross for effekten observert i dyresykdomsmodeller, er disse metoder fremdeles stå overfor begrensninger slik som behovet for suprafysiologiske doser for vekstfaktor levering, eller utilstrekkelig paracrineslipp ved celler alene. En mulig strategi for å overvinne de ovennevnte begrensningene er å kombinere stamcelle terapi og genterapi, hvorved stamceller er genetisk programmert ex vivo før transplantasjonen for å overuttrykker ønskelige terapeutiske faktorer. Denne tilnærmingen har blitt vist i ulike sykdomsmodeller inkludert bakben iskemi ^2, hjertesykdom ^tre, bein healing ⁴ og nerveskade ^5, osv.. Men de fleste genterapiteknikker avhengig av virale vektorer, noe som er forbundet med sikkerhetsproblemer som potensiell immunogenitet og innsettingen mutagenese. Biomaterials mediert ikke-virale gen levering kan overvinne disse begrensninger, men ofte lider av lav transfeksjon effektivitet. For å øke hastigheten på oppdagelsen av nye biomaterialer for effektiv ikke-virale genet levering, har nyere studier ansatt kombinatorisk kjemi og high-throughput screening tilnærming. Biologisk nedbrytbare polymer biblioteker slik som poly (β-amino esregistre) (PBAE) har blitt utviklet og vist, noe som førte til oppdagelsen av ledende polymerer med markant forbedret transfeksjon effektivitet sammenlignet med konvensjonelle polymere vektor kolleger. ^6-7

Heri beskrives syntesen av PBAE og verifisering av deres evne til å transfektere adipose-avledede stamceller (ADSCs) in vitro, etterfulgt av etterfølgende transplantasjon av genetisk-modifiserte ADSCs overekspresjon vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) i en murin modell av bakben iskemi . Resultatene ble evaluert ved å spore mobil skjebne ved hjelp Bioluminescens bildebehandling, vurdere vev reperfusjon ved hjelp av laser Doppler perfusjonsbilleddannende (LDPI), og bestemme angiogenese og vev berging av histologi.

Protocol

En. Polymer Synthesis I et avtrekksskap, veie ut 3523 mg av butandiol diacrylate (C) og overføre til et glass scintillasjonskyvette inneholder oppsikt bar. Forvarm 5-amino-1-pentanol (32) til 90 ° C for å oppløse saltet, og deretter i et avtrekksskap, veie ut 1,533 mg 32 og legge til scintillasjonsglass inneholdende C. Denne metode vil resultere i et molforhold av C: 32 = 1:1,2. Umiddelbart plassere hetteglasset med begge løsninger på en røre plate. Sett røre hastighet på 600 rpm….

Representative Results

Ved å blande sammen de positivt ladede polymer (C32-122), og negativt ladede DNA plasmid selv setter sammen til nanopartikler. Nanopartikkel formasjonen kan bli bekreftet gjennom elektroforese analyse dvs. complexation mellom C32-122 og plasmid DNA vil hindre mobilisering av DNA under elektroforese. Polymeren tjener som en reagens for å lette transfeksjon forbedret opptak av DNA i målcellene og den påfølgende ekspresjon av kodende proteiner (figur 2). Celler kan bli transfektert med noen t…

Discussion

Her rapporterer vi en metode for å programmere voksne stamceller til økt ekspresjon av terapeutiske faktorer ved hjelp av ikke-virale, biologisk nedbrytbare nanopartikler. Denne plattformen er spesielt nyttig for behandling av sykdommer hvor stamceller kan selvsagt hjemmet, slik som ischemi og kreft. ^9-10 Videre tillater den ikke-virale gen levering plattform for transient overekspresjon av terapeutiske forhold, som er egnet for de fleste vev regenerering og såret helbredende prosesser. Den transfeksjon Pr…

Materials

Name of the Reagent	Company	Catalogue Number	Comments (optional)
DMEM	Invitrogen	11965
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	10082
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15070
Basic Fibroblast Growth Factor	Peprotech	100-18B
1,4-Butanediol Diacrylate (90%)	Sigma Aldrich	411744	Acronym: C
5-amino-1-pentanol (97%)	Alfa Aesar	2508-29-4	Acronym: 32
Tetraethyleneglycoldiamine >99%)	Molecular Biosciences	17774	Acronym: 122
Sodium Acetate	G-Biosciences	R010
Phosphate Buffered Saline	Invitrogen	14190-144
Tetrahyofuran Anhydrous (>99.9%)	Sigma Aldrich	401757
Diethyl Ether Anhydrous (>99%)	Fisher Scientific	E138-4
DMSO Anhydrous (>99.9%)	Sigma Aldrich	276855
Gelatin	Sigma Aldrich	G9391
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200
D-luciferin	GoldBio
Optimal Cutting Temperature (O.C.T)	Tissue-Tek	4583
Rat anti-Mouse CD31	BD Pharmingen	550274
Alexa Fluor 594 anti-rat IgG	Invitrogen	A11007