Células-tronco de programação para Therapeutic angiogênese Usando nanopartículas poliméricas biodegradáveis
Summary
Descreve-se o método de células-tronco de programação para superexpressão fatores terapêuticos para angiogênese utilizando nanopartículas poliméricas biodegradáveis. Processos descritos incluem a síntese do polímero, a transfecção de células estaminais derivadas de tecido adiposo, in vitro, e para validar a eficácia das células estaminais programadas para promover a angiogénese num modelo de isquemia dos membros posteriores de murino.
Abstract
Crescimento vascular controlada é crítica para a regeneração de tecidos e cicatrização de feridas bem sucedida, bem como para o tratamento de doenças isquémicas, tais como acidente vascular cerebral, ataque cardíaco ou doenças arteriais periféricas. Entrega direta de fatores de crescimento angiogênicos tem o potencial de estimular o crescimento de novos vasos sanguíneos, mas é freqüentemente associada com limitações como a falta de direcionamento e meia-vida curta in vivo. A terapia genética oferece uma abordagem alternativa ao entregar genes que codificam fatores angiogênicos, mas muitas vezes requer o uso de vírus, e é limitada por questões de segurança. Aqui nós descrevemos uma estratégia desenvolvida recentemente para estimular o crescimento vascular por células-tronco de programação para superexpressão fatores angiogênicos in situ utilizando nanopartículas poliméricas biodegradáveis. Especificamente nossa estratégia utilizada células-tronco como veículos de entrega, tirando partido da sua capacidade de migrar para tecidos isquêmicos in vivo. Usando os vetores poliméricos otimizados, derivadas de tecido adiposoAs células estaminais foram modificados para sobre-expressar um gene que codifica angiogénico factor de crescimento endotelial vascular (VEGF). Nós descrevemos os processos para a síntese do polímero, a formação de nanopartículas, transfecção de células estaminais in vitro, bem como métodos para validar a eficácia das células estaminais que expressam VEGF para promover a angiogénese num modelo de isquemia dos membros posteriores de murino.
Introduction
O objetivo geral desta técnica é promover a angiogênese terapêutica com células-tronco não-viral programados superexpressão fatores terapêuticos no local da isquemia. As células-tronco foram modificadas ex vivo primeiro usando nanopartículas biodegradáveis sintetizados em laboratório, e depois transplantadas em um modelo murino de isquemia dos membros posteriores para validar o seu potencial para aumentar a angiogênese e salvamento tecido.
Crescimento vascular controlada é uma componente importante da regeneração de tecidos bem sucedido, bem como para o tratamento de várias doenças isquémicas, tais como acidente vascular cerebral, isquemia e enfarte do miocárdio. Várias estratégias têm sido desenvolvidos para promover o crescimento vascular, incluindo a entrega do factor de crescimento e terapia baseada em célula. Uma Apesar da eficácia observada em modelos animais da doença, estes métodos ainda enfrentam limitações, tais como a necessidade de doses suprafisiológicas de entrega do factor de crescimento, ou insuficiente parácrinaliberação pelas células isoladamente. Uma estratégia potencial para superar as limitações acima é combinar terapia celular e terapia génica, em que as células estaminais são geneticamente programados ex vivo antes da transplantação para sobre-expressar factores terapêuticos desejáveis. Esta abordagem tem sido demonstrada em vários modelos de doença incluindo isquemia dos membros posteriores 2, doença cardíaca 3, cicatrização do osso 4 e lesão neural 5, etc. No entanto, a maioria das técnicas de terapia genética dependem em vectores virais, os quais estão associados a problemas de segurança, tais como a imunogenicidade potencial e mutagénese insercional. Biomateriais mediadas entrega do gene não-viral pode superar essas limitações, mas muitas vezes sofrem de baixa eficiência de transfecção. Para acelerar a descoberta de novos biomateriais para a entrega do gene não-viral eficaz, estudos recentes têm empregue a química combinatória e de alto rendimento abordagem de triagem. Bibliotecas de polímeros biodegradáveis, tais como poli (es-amino βtros) (PBAE) têm sido desenvolvidos e rastreados, o que levou à descoberta de que conduzem polímeros com marcadamente melhorada a eficiência de transfecção em comparação com os homólogos vector poliméricos convencionais. 6-7
Aqui, nós descrevemos a síntese de PBAE e verificação da sua capacidade de transfectar células estaminais derivadas de tecido adiposo (ADSCs), in vitro, seguida de transplante subsequente de ADSCs geneticamente modificados que sobreexpressam o factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) em um modelo murino de isquemia dos membros posteriores . Os resultados foram avaliados através do rastreamento destino celular usando imagem de bioluminescência, avaliando reperfusão tecidual utilizando laser Doppler perfusão de imagem (LDPI), e determinar a angiogênese e tecido de resgate pela histologia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui nós relatamos um método para programar células-tronco adultas para superexpressão fatores terapêuticos usando não-virais, nanopartículas biodegradáveis. Esta plataforma é particularmente útil para o tratamento de doenças em que as células estaminais pode, naturalmente, de origem, tais como isquemia e cancro. 9-10 Além disso, a plataforma de entrega de genes não virais permite a sobre-expressão transitória de factores terapêuticos, o que é adequado para a maioria dos tecidos e de regener…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer American Heart Association Nacional Grant Scientist Desenvolvimento (10SDG2600001), Stanford Bio-X Programa Iniciativa Interdisciplinar e Programa de Pesquisa de Stanford Medical Scholars para financiamento.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| DMEM | Invitrogen | 11965 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10082 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15070 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Peprotech | 100-18B | |
| 1,4-Butanediol Diacrylate (90%) | Sigma Aldrich | 411744 | Acronym: C |
| 5-amino-1-pentanol (97%) | Alfa Aesar | 2508-29-4 | Acronym: 32 |
| Tetraethyleneglycoldiamine >99%) | Molecular Biosciences | 17774 | Acronym: 122 |
| Sodium Acetate | G-Biosciences | R010 | |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 14190-144 | |
| Tetrahyofuran Anhydrous (>99.9%) | Sigma Aldrich | 401757 | |
| Diethyl Ether Anhydrous (>99%) | Fisher Scientific | E138-4 | |
| DMSO Anhydrous (>99.9%) | Sigma Aldrich | 276855 | |
| Gelatin | Sigma Aldrich | G9391 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200 | |
| D-luciferin | GoldBio | ||
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T) | Tissue-Tek | 4583 | |
| Rat anti-Mouse CD31 | BD Pharmingen | 550274 | |
| Alexa Fluor 594 anti-rat IgG | Invitrogen | A11007 |
References
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