低温電子断層撮影法を用いて凍結 - 和状態で神経突起を可視化するための一次ニューロンの調製
Summary
超微細構造解析のための神経突起を維持するために、我々は、ガラス質氷の層に懸濁したサンプルを得瞬間冷凍に続く電子顕微鏡グリッド上に、一次ニューロンのメッキのためのプロトコルを記述します。これらのサンプルは、ナノメートルスケールでの構造を可視化するために低温電子顕微鏡で調べることができる。
Abstract
神経突起、樹状突起と軸索の両方が、神経細胞間の電気的インパルスの伝導を可能にする神経細胞の細胞プロセスである。神経突起の構造を定義すると、これらのプロセスは、シナプスのコミュニケーションをサポートする材料や信号を移動させる方法を理解することが重要です。電子顕微鏡（EM）は、伝統的に、神経突起内の超微細構造の特徴を評価するために使用したが、脱水、包埋樹脂中の有機溶媒への曝露は、構造を歪ませることができる。重要な満たされていない目標は、成果物の影響を受けていない構造的な評価を可能にする手順の製剤である。ここでは、成長していると低温電子断層撮影法（クライオ-ET）との試験に続いて、電子顕微鏡グリッド上の別の一次ニューロンのフラッシュ凍結全体の神経突起のための詳細かつ再現性のあるプロトコルを確立している。この技術は、ASSEを容易にする、ナノメートル分解能での凍結、水和した神経突起の3次元視覚化を可能にするその形態学的差異のssment。我々のプロトコルは、後根神経節（DRG）神経突起とそのネイティブに近い状態での海馬神経突起の可視化の前例のないビューが得られます。このように、これらの方法は、通常の神経細胞と神経疾患の影響を受けたものの両方の神経突起上の今後の研究のための基盤を作成します。
Introduction
ニューロンは、下流の神経細胞と通信するために、多くの場合、非常に長い、情報および軸索を受け取るために樹状突起を工夫することにより、中枢神経系および末梢神経系の機能のために複雑な回路が必要不可欠確立。神経突起伸長は、神経突起の胚発生と神経分化やメンテナンス時の基本的な役割を果たしている批判的に神経系の機能をサポートしています。神経突起は、神経の損傷と再生だけでなく、神経系疾患で批判的に備えています。神経細胞の建築の研究では、正常および疾患脳の両方を理解することが重要である。幸いなことに、生理学的に関連する神経細胞培養系は、複雑な異種の細胞構造を再現することができますが存在する。固体実験プラットフォームの解明に基づいて、ニューロン形態の定性的および定量的分析を可能にする効果的な可視化戦略が必要とされている。特に有用なのだろうナノメートルスケールでの神経突起、軸索と樹状突起の両方を可視化するための一貫性のあるプラットフォームを提供し、詳細な方法論であること。
伝統的な電子顕微鏡検査は、それらの真の状態から試験片の歪みを誘発することができ、脱水、包埋樹脂中の有機溶媒の使用を必要とする。従って、4,9,25所見の解釈を制限する-これまでに、ナノメートルスケールで最も構造的特徴付けは、このような過酷な化学物質にさらされる大きな細胞または組織に基づく。また、電子ビームの浸透のために、切片を1μm12よりも大きい厚さを示す生物または細胞の突起に必要です。最後に、神経突起の細長い特徴の面倒な定義を作り、個別のスライスのデータ·セットのコレクション、組織切片または結果を粉砕した。偶数クライオEMのために、凍結した水和試料を切片化することが可能である、本方法は、圧縮を導入ARTIF行為1。
近年では、研究者は、その後、凍結ET 8,10,18,23を使用して神経突起を可視化するために、EMグリッドとフラッシュ凍結して液体エタン中に直接海馬ニューロンを成長させる方法を学びました。しかし、このような研究は、カスタムメイドの装置10,23、または日常可視化8,18ための十分薄いガラス質氷を生成するためのブロッティング手順の欠如詳細を使用するか。例えば、ある研究では、EMグリッド10をブロッティングに30〜40秒を使用することを推奨していますが、この値は、一般的な使用のためではない最適化されたが、そのカスタムメイドプランジ凍結デバイスに固有のものです。プランジ凍結にサンプルを前に湿度を維持するためのカスタムメイドのデバイスではなく、市販の1 17を使用すると、広範囲に再現するためのハードルを提起することができます。
これらの研究は低温ETによって神経突起を視覚化する画期的なされてきたが、我々は、APを探索するためにさらに一歩撮影した神経細胞の標本（海馬および後根神経節ニューロン）の様々なクライオ-ETのplicability。さらに、当社は、最適と部分最適の結果だけでなく、1がそのような標本のためにクライオ-ETの使用中に発生する可能性のある潜在的な成果物の両方を議論する。
ネイティブに近い状態に維持し、ナノメートルスケールでの全神経突起を可視化するための詳細な方法を定義することは、超微細構造の研究を行うことがより研究者のための能力を高めるだろう。この目的のために、我々は、神経突起を可視化するために未定着、非染色ニューロンを調製するために、市販の装置を使用して効果的かつ詳細なプロトコルを記載している。これは健全な神経突起の超微細構造を詳述し、構造的な違いは、神経系の疾患モデルに存在しているかを理解するための基礎を築くために向けた重要な第一歩である。クライオETはナノメートルスケールでの3-Dで固定されていない、無染色の神経突起の機能を解決することができますので、この方法は、それが可能であることはありませんようになります神経炎アーキテクチャ12を定義するための前部。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々は、ラット胚性ニューロン（後根神経節および海馬）は金電子顕微鏡（EM）グリッド上に成長した2-DクライオEM及び3-Dクライオを用いて撮像されるそれらの神経突起のために十分に薄いガラス質氷中で凍結することができることを示してET。海馬の神経突起が以前に凍結ET 8,10,18,23を使用して画像化してきたが、市販の装置を使用して正常なレプリケーションのための十分な詳細な?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、NIHの助成金（PN2EY016525とP41GM103832）によって支えられてきた。 SHSは湾岸コンソーシアム（NIH認可番号T32EB009379）の学際的バイオサイエンス教育のためのWMケックセンターのナノバイオロジー学際大学院教育プログラムからの交わりによってサポートされていました。
SHSは、解剖し成長し、DRGおよび海馬細胞をガラス化し、低温電子顕微鏡およびDRGと海馬軸索の凍結ETデータを収集し、再構成され、チルトシリーズは色注釈付き。 MRGを切開し、MNRの研究室での海馬細胞を提供した。 SCは、チルトシリーズ注釈を支援。 SHSは、神経細胞を分析し、成長する方法についてのCWで訓練された。 SHS、WCMとトイレは実験を考案。 SHSは他の著者からの入力に原稿を用意しました。
このビデオは、TのBiozentrumの細胞イメージングとNanoAnalyticsセンター（C-シーナ）で撮影されました大学バーゼル彼。 C-シーナは、スイスのバーゼルに位置連邦工科大学チューリッヒのバイオシステムズ科学工学部門（D-BSSE）に統合されています。
Materials
| Dumont #7 Tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72803-01 | For handling EM grids |
| Glass bottom dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-10C | For growing sample |
| Electron microscopy grids | Quantifoil | Holey Carbon, Au 200, R 2/2 | For growing sample |
| Calcium-free filter paper | Whatman | 1541-055 | For blotting sample |
| Large flat point long tweezers | Excelta Corporation | E003-000590, 25-SA | For blotting sample |
| Vitrification device and tweezers | FEI | Vitrobot Mark III | For freezing sample |
| Mini grid storage boxes | Ted Pella, Inc. | 160-40 | For storing EM grids |
| Cryo transfer holder | Gatan | 626 Single Tilt Liquid Nitrogen Cryo Transfer Holder | For imaging samples |
| Semi-automated tilt series acquisition software | SerialEM | http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | For imaging samples |
| Image processing software | IMOD eTomo | http://bio3d.colorado.edu/imod/ | For image processing |
| Transmission electron microscope for cryoEM | JEOL, Tokyo | 200-kV JEM2100 LaB6 electron microscope | For imaging samples |
| 4k x 4k CCD camera | Gatan | N/A | For imaging samples |
| 3-D annotation software | Visage Imaging GmbH | Amira/Avizo | For processing 3-D data |
| Software for digitally stitching 2-D images | Adobe | Adobe Photoshop | For processing 2-D data |
| DMEM, High Glucose | Invitrogen | 11965-118 | For hippocampal culture |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B-0252 | For hippocampal culture |
| Sodium tetraborate | Sigma Aldrich | B-9876 | For hippocampal culture |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P2636-500MG | For hippocampal culture |
| Filter system | Corning | 430758 | For hippocampal culture |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | For DRG culture |
| B-27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | For DRG culture |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | For DRG culture |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | For DRG culture |
| Recombinant rat b-NGF | R&D Systems | 556-NG | For DRG culture |
| Uridine | Sigma | U3003-5G | For DRG culture |
| 5'-Fluoro-2'-deoxyuridine | Sigma | F0503-100MG | For DRG culture |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | For DRG culture |
References
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