Preparação de primário neurônios para visualizar Neuritos num Estado Frozen-hidratado Usando Cryo-Electron Tomografia
Summary
Para preservar processos neuronais para análise ultra-estrutural, nós descrevemos um protocolo para revestimento dos neurônios primários em grades de microscopia eletrônica seguido de congelamento flash, rendendo amostras suspensas em uma camada de gelo vítreo. Essas amostras podem ser examinadas com um microscópio crio-eletrônico para visualizar estruturas em escala nanométrica.
Abstract
Neuritos, ambos os dendritos e axônios, são processos celulares neuronais que permitem a condução de impulsos elétricos entre os neurônios. Definir a estrutura de neurites é fundamental para a compreensão de como esses processos mover materiais e sinais que suportem comunicação sináptica. A microscopia eletrônica (EM) tem sido tradicionalmente usada para avaliar as características ultra-estruturais dentro de neurites, no entanto, a exposição a solventes orgânicos durante a desidratação e resina incorporação podem alterar as estruturas. Um objetivo importante não atendida é a formulação de procedimentos que permitam avaliações estruturais não impactadas por tais artefatos. Aqui, nós estabelecemos um protocolo detalhado e reprodutível para o cultivo e de congelamento de flash neurites inteiros de diferentes neurônios primários em grades de microscopia eletrônica, seguido por seu exame com tomografia crio-elétron (crio-ET). Esta técnica permite a visualização 3-D de congelados, neurites hidratados com resolução nanométrica, facilitando assessment de suas diferenças morfológicas. Nosso protocolo produz uma visão sem precedentes da raiz dorsal (DRG) gânglio neurites, e uma visualização de neurites hipocampo em seu estado quase original. Como tal, estes métodos de criar uma base para futuros estudos sobre neurites de ambos os neurônios normais e aqueles afetados por distúrbios neurológicos.
Introduction
Neurónios estabelecer o essencial circuitos complexos para a função dos sistemas nervosos central e periférico, através da elaboração de dendrites e axónios receber informação, muitas vezes muito demorado, para se comunicar com os neurónios a jusante. Crescimento de neurites desempenha um papel fundamental durante o desenvolvimento embrionário e na diferenciação e manutenção de neurites neuronal suporta criticamente a função do sistema nervoso. Processos neuriticos também apresentam criticamente em lesões neuronais e de regeneração, bem como distúrbios do sistema nervoso. O estudo da arquitetura neuronal é crucial para entender tanto o cérebro normal e doente. Felizmente, existem sistemas de cultura de células neuronais fisiologicamente relevantes que podem recapitular estruturas celulares complexos e heterogêneos. Com base na elucidação de plataformas experimentais sólidos, estratégias eficazes de visualização que permitem análises qualitativas e quantitativas da morfologia neuronal são necessários. Especialmente útil seriaser uma metodologia detalhada que fornece uma plataforma consistente para a visualização de neurites, ambos os axônios e dendritos em escala nanométrica.
Microscopia tradicional elétron requer o uso de solvente orgânico durante a desidratação e incorporação de resina, o que pode induzir distorções nas amostras de seu verdadeiro estado. Até à data, a maioria das caracterizações estruturais em escala nanométrica são baseados em células ou tecidos maiores, que são submetidos a tais produtos químicos – limitando, assim, a interpretação dos resultados 4,9,25. Além disso, para a penetração do feixe de electrões, de corte é necessária para que os organismos celulares ou saliências que apresentam uma espessura superior a 1 um 12. Finalmente, os resultados de tecido seccionados ou branqueado no conjunto de conjuntos de dados discretos específico slice, tornando complicada a definição da característica alongada de neurites. Mesmo para crio-EM, em que o corte de um espécime congelado hidratado é possível, o método apresenta compressão ArtifAtos 1.
Nos últimos anos, os pesquisadores aprenderam a crescer neurônios do hipocampo diretamente em grades e EM-los em etano líquido para visualizar posteriormente neurites usando crio-ET 8,10,18,23 de congelamento flash. No entanto, tais estudos ou usar um dispositivo feito sob medida 10,23, ou detalhes de falta na etapa mata-borrão para a geração de gelo vítreo suficientemente fina para visualização rotina 8,18. Por exemplo, um estudo recomenda o uso de 30-40 segundos para secar a grade EM 10, no entanto, este valor não é otimizado para uso geral, mas é específico para esse dispositivo de congelamento mergulho feito por encomenda. Usando um dispositivo feito sob medida, em vez de um comercialmente disponível um 17 para a manutenção de umidade antes de mergulhar de congelamento da amostra pode representar um obstáculo para a reprodutibilidade generalizada.
Embora esses estudos têm sido inovador em visualizar neurites por crio-ET, demos um passo à frente para explorar a applicability de crio-ET para uma variedade de amostras (neuronais do hipocampo e do gânglio da raiz dorsal, neurónios). Além disso, discute-se ambos os resultados ótimos e subótimos, bem como os possíveis artefatos que se pode encontrar usando crio-ET para tais espécimes.
Definindo uma técnica detalhada para a preservação e visualizar neurites inteiros em escala nanométrica em um estado quase nativo iria aumentar a capacidade para mais pesquisadores para realizar estudos ultra-estruturais. Para este efeito, descrevem um protocolo eficaz e detalhado usando equipamentos disponíveis comercialmente para preparar a não fixadas, os neurónios não-coradas para visualizar as neurites. Este é um primeiro passo importante para detalhar a ultra-estrutura das neurites saudáveis e estabelecer as bases para a compreensão do que estão presentes em modelos de doenças do sistema nervoso diferenças estruturais. Desde crio-ET pode resolver não corrigidos, características neurite não coradas em 3-D em escala nanométrica, o método, será possível, como nunca serantes de definir a arquitetura neuritic 12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós mostramos que ratos neurônios embrionários (gânglio da raiz dorsal e hipocampo) podem ser cultivadas em microscopia eletrônica de ouro (EM) grades e congelado em gelo vítreo fina o suficiente para as suas neurites a ser fotografada usando 2-D crio-EM e 3-D crio- ET. Enquanto neurites hipocampo foram previamente visualizados utilizando crio-ET 8,10,18,23, um protocolo detalhado para a replicação suficiente de sucesso utilizando dispositivos comercialmente disponíveis tem faltado. Além disso, enqu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi suportada pelos NIH bolsas (PN2EY016525 e P41GM103832). SHS foi apoiado por uma bolsa do Programa do Centro Keck WM Interdisciplinar de Biociências de Formação da Costa do Golfo Consórcios (NIH Grant No. T32EB009379) Formação de Pós-Graduação Interdisciplinar Nanobiologia.
SHS dissecado, cresceu e vitrificados DRG e células do hipocampo; coletadas crio-EM e dados crio-ET de DRG e axônios do hipocampo; reconstruído e cor-anotada a série de inclinação. MRG dissecado e desde as células do hipocampo no laboratório do MNR. SC assistida em anotação série de inclinação. SHS foi treinado por CW sobre como dissecar e crescer neurônios. SHS, WCM e WC concebeu os experimentos. SHS preparou o manuscrito com a entrada de outros autores.
Este vídeo foi filmado no Centro de Imaging and Cellular NanoAnalytics (C-CINA) do Biozentrum de tele Universidade de Basel. C-CINA está integrada no Departamento de Ciência e Engenharia Biosystems (D-BSSE) da ETH Zürich, localizada em Basileia, Suíça.
Materials
| Dumont #7 Tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72803-01 | For handling EM grids |
| Glass bottom dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-10C | For growing sample |
| Electron microscopy grids | Quantifoil | Holey Carbon, Au 200, R 2/2 | For growing sample |
| Calcium-free filter paper | Whatman | 1541-055 | For blotting sample |
| Large flat point long tweezers | Excelta Corporation | E003-000590, 25-SA | For blotting sample |
| Vitrification device and tweezers | FEI | Vitrobot Mark III | For freezing sample |
| Mini grid storage boxes | Ted Pella, Inc. | 160-40 | For storing EM grids |
| Cryo transfer holder | Gatan | 626 Single Tilt Liquid Nitrogen Cryo Transfer Holder | For imaging samples |
| Semi-automated tilt series acquisition software | SerialEM | http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | For imaging samples |
| Image processing software | IMOD eTomo | http://bio3d.colorado.edu/imod/ | For image processing |
| Transmission electron microscope for cryoEM | JEOL, Tokyo | 200-kV JEM2100 LaB6 electron microscope | For imaging samples |
| 4k x 4k CCD camera | Gatan | N/A | For imaging samples |
| 3-D annotation software | Visage Imaging GmbH | Amira/Avizo | For processing 3-D data |
| Software for digitally stitching 2-D images | Adobe | Adobe Photoshop | For processing 2-D data |
| DMEM, High Glucose | Invitrogen | 11965-118 | For hippocampal culture |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B-0252 | For hippocampal culture |
| Sodium tetraborate | Sigma Aldrich | B-9876 | For hippocampal culture |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P2636-500MG | For hippocampal culture |
| Filter system | Corning | 430758 | For hippocampal culture |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | For DRG culture |
| B-27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | For DRG culture |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | For DRG culture |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | For DRG culture |
| Recombinant rat b-NGF | R&D Systems | 556-NG | For DRG culture |
| Uridine | Sigma | U3003-5G | For DRG culture |
| 5'-Fluoro-2'-deoxyuridine | Sigma | F0503-100MG | For DRG culture |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | For DRG culture |
References
- Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. EMBO J. 23, 3583-3588 (2004).
- Benzing, W. C., Mufson, E. J., Armstrong, D. M. Alzheimer’s disease-like dystrophic neurites characteristically associated with senile plaques are not found within other neurodegenerative diseases unless amyloid beta-protein deposition is present. Brain Res. 606, 10-18 (1993).
- Binks, B. P. . Modern characterization methods of surfactant systems. , (1999).
- Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr. Opin. Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
- Chen, S., et al. Electron cryotomography of bacterial cells. J. Vis. Exp. (39), e1943 (2010).
- DiFiglia, M., et al. Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain. Science. 277, 1990-1993 (1997).
- Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W. Frozen aqueous suspensions. Ultramicroscopy. 10, 55-61 (1982).
- Fernández-Busnadiego, R., et al. Insights into the molecular organization of the neuron by cryo-electron tomography. J. Electron Microsc. 60, 137-148 (2011).
- Frey, T. G., Perkins, G. A., Ellisman, M. H. Electron tomography of membrane-bound cellular organelles. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 199-224 (2006).
- Garvalov, B. K., et al. Luminal particles within cellular microtubules. J. Cell. Biol. 174, 759-765 (2006).
- Grünewald, K., Cyrklaff, M. Structure of complex viruses and virus-infected cells by electron cryo tomography. Curr. Opin. Microbiol. 9, 437-442 (2006).
- Gu, J., Bourne, P. E. . Structural bioinformatics. , (2009).
- De Hoop, M. J., Meyn, L., Dotti, C. G. Culturing hippocampal neurons and astrocytes from fetal rodent brain. Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, (1998).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
- Fink, C. C., et al. Selective regulation of neurite extension and synapse formation by the beta but not the alpha isoform of CaMKII. Neuron. 39, 283-297 (2003).
- Jacob, W. A., et al. Mitochondrial matrix granules: their behavior during changing metabolic situations and their relationship to contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Microsc. Res. Tech. 27, 307-318 (1994).
- Jensen, G. J., Briegel, A. How electron cryotomography is opening a new window onto prokaryotic ultrastructure. Curr. Opin. Struct. Biol. 17, 260-267 (2007).
- Ibiricu, I., et al. Cryo Electron Tomography of Herpes Simplex Virus during Axonal Transport and Secondary Envelopment in Primary Neurons. PLoS Pathog. 7, e1002406 (2011).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Koning, R. I., et al. Cryo electron tomography of vitrified fibroblasts: microtubule plus ends in situ. J. Struct. Biol. 161, 459-468 (2008).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).
- Lotharius, J., Brundin, P. Pathogenesis of Parkinson’s disease: dopamine, vesicles and alpha-synuclein. Nat. Rev. Neurosci. 3, 932-942 (2002).
- Lucić, V., et al. Multiscale imaging of neurons grown in culture: from light microscopy to cryo-electron tomography. J. Struct. Biol. 160, 146 (2007).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and. 2, 152-160 (2007).
- Marsh, B. J. Lessons from tomographic studies of the mammalian Golgi. Biochim. Biophys. Acta. 1744, 273-292 (2005).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J. Struct. Biol. 152, 36-51 (2005).
- Medalia, O., et al. Organization of actin networks in intact filopodia. Curr. Biol. 17, 79-84 (2007).
- Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298, 1209-1213 (2002).
- Meyerson, J. R., et al. Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging. J. Vis. Exp. (58), e2770 (2011).
- Nakatomi, H., et al. Regeneration of Hippocampal Pyramidal Neurons after Ischemic Brain Injury by Recruitment of Endogenous Neural Progenitors. Cell. 110, 429-441 (2002).
- Peachey, L. D. Electron Microscopic Observations on the Accumulation of Divalent Cations in Intramitochondrial Granules. J. Cell. Biol. 20, 95-111 (1964).
- Raza, M., et al. Aging is associated with elevated intracellular calcium levels and altered calcium homeostatic mechanisms in hippocampal neurons. Neurosci. Lett. 418, 77-81 (2007).
- Scroggs, R. S., Fox, A. P. Calcium current variation between acutely isolated adult rat dorsal root ganglion neurons of different size. J. Physiol. 445, 639-658 (1992).
- Squire, L. R. . Fundamental neuroscience. , (2003).
- Sulzer, D. Multiple hit hypotheses for dopamine neuron loss in Parkinson’s disease. Trends Neurosci. 30, 244-250 (2007).
- Tapia, J. C., et al. Early expression of glycine and GABA(A) receptors in developing spinal cord neurons. Effects on neurite outgrowth. 신경과학. 108, 493-506 (2001).
