क्रायो इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी का प्रयोग एक जमे हुए हाइड्रेटेड राज्य में neurites दृश्यमान करने के लिए प्राथमिक न्यूरॉन्स की तैयारी
Summary
Ultrastructural विश्लेषण के लिए neuronal प्रक्रियाओं की रक्षा करने के लिए, हम कांच बर्फ की एक परत में निलंबित नमूने उपज, फ़्लैश ठंड से पीछा इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड पर प्राथमिक न्यूरॉन्स के चढ़ाना के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. इन नमूनों नैनोमीटर पैमाने पर संरचनाओं कल्पना करने के लिए एक क्रायो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप से जांच की जा सकती.
Abstract
Neurites, दोनों dendrites और axons, न्यूरॉन्स के बीच बिजली के उद्यमी के चालन सक्षम है कि neuronal सेलुलर प्रक्रियाओं हैं. Neurites की संरचना को परिभाषित करने के लिए इन प्रक्रियाओं synaptic संचार का समर्थन करते सामग्री और संकेतों को स्थानांतरित कैसे समझ के लिए महत्वपूर्ण है. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) पारंपरिक neurites भीतर ultrastructural सुविधाओं का आकलन किया गया है, तथापि, निर्जलीकरण और राल एम्बेडिंग दौरान कार्बनिक विलायक के लिए जोखिम संरचनाओं विकृत कर सकते हैं. एक महत्वपूर्ण unmet लक्ष्य ऐसी कलाकृतियों से प्रभावित नहीं संरचनात्मक मूल्यांकन के लिए अनुमति देते हैं कि प्रक्रियाओं के निर्माण है. यहाँ, हम बढ़ रही है और क्रायो इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी (क्रायो ईटी) के साथ अपने परीक्षण के बाद इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड पर विभिन्न प्राथमिक न्यूरॉन्स की फ्लैश ठंड पूरे neurites के लिए एक विस्तृत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल की स्थापना की है. इस तकनीक asse की सुविधा, नैनोमीटर प्रस्ताव पर जमे हुए, हाइड्रेटेड neurites की 3 डी दृश्य के लिए अनुमति देता हैउनके रूपात्मक मतभेद की ssment. हमारे प्रोटोकॉल पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि (डीआरजी) neurites, और उनके पास देशी राज्य में हिप्पोकैम्पस neurites की एक दृश्य की एक अभूतपूर्व दृश्य पैदावार. जैसे, इन तरीकों सामान्य न्यूरॉन्स और मस्तिष्क संबंधी बीमारियों से प्रभावित उन दोनों के neurites पर भविष्य के अध्ययन के लिए एक आधार बना.
Introduction
न्यूरॉन्स बहाव के न्यूरॉन्स के साथ संवाद करने के लिए जानकारी और axons, अक्सर काफी लंबा, प्राप्त करने के लिए डेन्ड्राइट विस्तार से मध्य और परिधीय तंत्रिका प्रणाली के समारोह के लिए जटिल circuitry आवश्यक स्थापना. Neurite परिणाम तंत्रिका तंत्र के लिए गंभीर समारोह का समर्थन करता है भ्रूण विकास और neuronal भेदभाव और neurites के रखरखाव के दौरान एक मौलिक भूमिका निभाता है. Neuritic प्रक्रियाओं को भी neuronal चोट और उत्थान, साथ ही तंत्रिका तंत्र संबंधी विकार में गंभीर रूप से शामिल हैं. neuronal वास्तुकला का अध्ययन दोनों सामान्य और रोगग्रस्त मस्तिष्क को समझने के लिए महत्वपूर्ण है. सौभाग्य से, physiologically प्रासंगिक neuronal सेल संस्कृति प्रणालियों कि जटिल और विषम सेलुलर संरचनाओं पुनरावृत्ति कर सकते मौजूद हैं. ठोस प्रयोगात्मक प्लेटफार्मों, neuronal आकारिकी के गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण है कि सक्षम प्रभावी दृश्य रणनीतियों की व्याख्या के आधार पर आवश्यक हैं. विशेष रूप से उपयोगी होगानैनोमीटर पैमाने पर neurites, दोनों axons और dendrites दृश्यमान करने के लिए एक सुसंगत मंच प्रदान करता है कि एक विस्तृत कार्यप्रणाली हो.
पारंपरिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी उनकी सही स्थिति से नमूनों में विकृति पैदा कर सकते हैं, जो निर्जलीकरण और राल एम्बेडिंग दौरान कार्बनिक विलायक का उपयोग आवश्यक है. इस प्रकार निष्कर्ष 4,9,25 की व्याख्या सीमित – तिथि करने के लिए, नैनोमीटर स्तर पर सबसे संरचनात्मक अभिलक्षण ऐसे कठोर रसायनों के अधीन हैं कि बड़े कोशिकाओं या ऊतकों पर आधारित हैं. इसके अलावा, इलेक्ट्रॉन बीम प्रवेश के लिए, सेक्शनिंग 1 माइक्रोन 12 से अधिक मोटाई का प्रदर्शन जीवों या सेलुलर protrusions के लिए आवश्यक है. अंत में, neurites की लम्बी फीचर के बोझिल परिभाषा बनाने, असतत टुकड़ा विशेष सेट डेटा के संग्रह में ऊतक परिणाम sectioned या milled. यहां तक कि क्रायो EM के लिए, एक जमे हुए हाइड्रेटेड नमूना सेक्शनिंग संभव है, जिसमें विधि संपीड़न artif का परिचय1 में कार्य करता है.
हाल के वर्षों में, शोधकर्ताओं ने ईएम ग्रिड और फ्लैश ठंड बाद में क्रायो एट 8,10,18,23 का उपयोग neurites कल्पना करने के लिए तरल एटैन में उन पर सीधे hippocampal न्यूरॉन्स बढ़ने की सीख लिया है. हालांकि, इस तरह के अध्ययन के लिए एक कस्टम बनाया डिवाइस 10,23, या दिनचर्या दृश्य 8,18 के लिए पतली पर्याप्त शीशे बर्फ पैदा करने के लिए सोख्ता कदम पर कमी विवरणों का उपयोग या तो. उदाहरण के लिए, एक अध्ययन ईएम ग्रिड 10 सोख्ता के लिए 30-40 सेकंड के उपयोग की सिफारिश की है, लेकिन, इस मूल्य सामान्य उपयोग के लिए नहीं अनुकूलित लेकिन उस कस्टम बनाया डुबकी ठंड डिवाइस के लिए विशिष्ट है. डुबकी ठंड के लिए नमूना पिछले नमी बनाए रखने के लिए एक कस्टम बनाया डिवाइस के बजाय एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एक 17 का प्रयोग बड़े पैमाने पर reproducibility के लिए एक बाधा बन सकता है.
इन अध्ययनों क्रायो ईटी से neurites visualizing में groundbreaking किया गया है, हम एपी का पता लगाने के लिए एक कदम आगे ले लिया हैneuronal नमूनों (हिप्पोकैम्पस और पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स) की एक किस्म के लिए क्रायो एट के plicability. इसके अतिरिक्त, हम इष्टतम और suboptimal परिणाम है, साथ ही एक ऐसे नमूनों के लिए क्रायो एट का उपयोग मुठभेड़ सकता है कि संभावित कलाकृतियों दोनों पर चर्चा की.
एक के पास देशी राज्य में संरक्षण और नैनोमीटर पैमाने पर पूरे neurites दृश्यमान करने के लिए एक विस्तृत तकनीक परिभाषित ultrastructural पढ़ाई बाहर ले जाने के लिए अधिक शोधकर्ताओं के लिए क्षमता में वृद्धि होगी. यह अंत करने के लिए, हम neurites कल्पना करने unfixed, बेदाग न्यूरॉन्स तैयार करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उपकरणों का उपयोग कर एक प्रभावी और विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन. यह स्वस्थ neurites की फैटी ब्यौरा और संरचनात्मक अंतर तंत्रिका तंत्र रोग मॉडल में मौजूद हैं क्या समझ के लिए नींव रखना ओर एक महत्वपूर्ण पहला कदम है. क्रायो एट नैनोमीटर पैमाने पर 3 डी में unfixed, बेदाग neurite सुविधाओं को हल कर सकते हैं, विधि यह संभव कभी नहीं के रूप में हो कर देगाneuritic वास्तुकला 12 को परिभाषित करने के लिए सामने.
Protocol
Representative Results
Discussion
हम चूहे भ्रूण न्यूरॉन्स (पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि और हिप्पोकैम्पस) सोने इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) ग्रिड पर वृद्धि हुई है और 2 डी क्रायो EM और 3 डी क्रायो का उपयोग imaged किया जा करने के लिए अपने neurites के लिए…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध एनआईएच अनुदान (PN2EY016525 और P41GM103832) द्वारा समर्थित किया गया है. एसएचएस खाड़ी तट भागीदारी (एनआईएच अनुदान सं T32EB009379) के अंतःविषय बायोसाइंस प्रशिक्षण के लिए WM उबकना केंद्र की Nanobiology अंतःविषय स्नातक प्रशिक्षण कार्यक्रम से एक फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया.
एसएचएस, विच्छेदित हुआ और डीआरजी और हिप्पोकैम्पस कोशिकाओं vitrified, क्रायो EM और डीआरजी और हिप्पोकैम्पस axons की क्रायो एट डेटा एकत्र; खंगाला और झुकाव श्रृंखला रंग से एनोटेट. MRG विच्छेदित और MNR प्रयोगशाला में हिप्पोकैम्पस कोशिकाओं प्रदान की है. अनुसूचित जाति झुकाव श्रृंखला एनोटेशन में सहायता प्रदान की. एसएचएस न्यूरॉन्स काटना और कैसे विकसित करने पर CW द्वारा प्रशिक्षित किया गया था. एसएचएस, WCM और WC प्रयोगों की कल्पना की. एसएचएस अन्य लेखकों से इनपुट के साथ पांडुलिपि तैयार.
इस वीडियो टी के Biozentrum के सेलुलर इमेजिंग और NanoAnalytics (सी Cina) के लिए केंद्र में फिल्माया गया थाविश्वविद्यालय बेसल वह. सी Cina बेसल, स्विट्जरलैंड में स्थित ETH ज्यूरिख, के Biosystems विज्ञान और इंजीनियरिंग (डी BSSE) के लिए विभाग में एकीकृत है.
Materials
| Dumont #7 Tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72803-01 | For handling EM grids |
| Glass bottom dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-10C | For growing sample |
| Electron microscopy grids | Quantifoil | Holey Carbon, Au 200, R 2/2 | For growing sample |
| Calcium-free filter paper | Whatman | 1541-055 | For blotting sample |
| Large flat point long tweezers | Excelta Corporation | E003-000590, 25-SA | For blotting sample |
| Vitrification device and tweezers | FEI | Vitrobot Mark III | For freezing sample |
| Mini grid storage boxes | Ted Pella, Inc. | 160-40 | For storing EM grids |
| Cryo transfer holder | Gatan | 626 Single Tilt Liquid Nitrogen Cryo Transfer Holder | For imaging samples |
| Semi-automated tilt series acquisition software | SerialEM | http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | For imaging samples |
| Image processing software | IMOD eTomo | http://bio3d.colorado.edu/imod/ | For image processing |
| Transmission electron microscope for cryoEM | JEOL, Tokyo | 200-kV JEM2100 LaB6 electron microscope | For imaging samples |
| 4k x 4k CCD camera | Gatan | N/A | For imaging samples |
| 3-D annotation software | Visage Imaging GmbH | Amira/Avizo | For processing 3-D data |
| Software for digitally stitching 2-D images | Adobe | Adobe Photoshop | For processing 2-D data |
| DMEM, High Glucose | Invitrogen | 11965-118 | For hippocampal culture |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B-0252 | For hippocampal culture |
| Sodium tetraborate | Sigma Aldrich | B-9876 | For hippocampal culture |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P2636-500MG | For hippocampal culture |
| Filter system | Corning | 430758 | For hippocampal culture |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | For DRG culture |
| B-27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | For DRG culture |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | For DRG culture |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | For DRG culture |
| Recombinant rat b-NGF | R&D Systems | 556-NG | For DRG culture |
| Uridine | Sigma | U3003-5G | For DRG culture |
| 5'-Fluoro-2'-deoxyuridine | Sigma | F0503-100MG | For DRG culture |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | For DRG culture |
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