Preparación de las neuronas primarias para la visualización de neuritas en un Estado Frozen-hidratado con Cryo-tomografía electrónica
Summary
Para preservar los procesos neuronales para el análisis ultraestructural, se describe un protocolo para la siembra de las neuronas primarias en rejillas de microscopía electrónica, seguido de congelación instantánea, dando muestras en suspensión en una capa de hielo vítreo. Estas muestras pueden ser examinados con un crio-microscopio electrónico para visualizar estructuras a escala nanométrica.
Abstract
Las neuritas, ambos dendritas y axones, son procesos celulares neuronales que permiten la conducción de impulsos eléctricos entre las neuronas. Definición de la estructura de neuritas es fundamental para la comprensión de cómo estos procesos se mueven materiales y señales que permiten la comunicación sináptica. La microscopía electrónica (EM) se ha utilizado tradicionalmente para evaluar las características ultraestructurales dentro de neuritas, sin embargo, la exposición a disolventes orgánicos durante la deshidratación y la incrustación de resina puede distorsionar las estructuras. Una meta insatisfecha importante es la formulación de procedimientos que permitan evaluaciones estructurales no afectados por este tipo de artefactos. Aquí, hemos establecido un protocolo detallado y reproducible para el cultivo y el flash de congelación neuritas enteras de diferentes neuronas primarias sobre rejillas de microscopía electrónica, seguida de su examen con la crio-tomografía electrónica (crio-ET). Esta técnica permite la visualización 3-D de las neuritas, hidratados congelados a una resolución de nanómetros, facilitando ASSEssment de sus diferencias morfológicas. Nuestro protocolo se obtiene una visión sin precedentes de la raíz dorsal (GRD) ganglio neuritas, y una visualización de neuritas hipocampo en su estado casi nativo. Como tales, estos métodos crean una base para futuros estudios sobre neuritas de las neuronas normales y los afectados por trastornos neurológicos.
Introduction
Las neuronas establecen el complejo esencial de circuitos para la función de los sistemas nerviosos central y periférico mediante la elaboración de dendritas para recibir información y axones, a menudo bastante largo, para comunicarse con las neuronas aguas abajo. El crecimiento de neuritas juega un papel fundamental durante el desarrollo embrionario y la diferenciación y el mantenimiento de las neuritas neuronal apoya críticamente la función del sistema nervioso. Procesos neuríticas también disponen de forma crítica en la lesión y la regeneración neuronal, así como trastornos del sistema nervioso. El estudio de la arquitectura neuronal es fundamental para comprender tanto el cerebro normal y enfermo. Afortunadamente, existen sistemas de cultivo de células neuronales fisiológicamente relevantes que pueden recapitular las estructuras celulares complejas y heterogéneas. Basado en la elucidación de las plataformas experimentales sólidas, estrategias de visualización eficaces que permitan a los análisis cualitativos y cuantitativos de morfología neuronal se necesitan. Especialmente útil seríaser una metodología detallada que proporciona una plataforma consistente para la visualización de las neuritas, tanto axones y dendritas en la escala nanométrica.
Microscopía electrónica tradicional requiere el uso de disolvente orgánico durante la deshidratación y la incrustación de resina, que puede inducir distorsiones en los especímenes de su verdadero estado. Hasta la fecha, la mayoría de las caracterizaciones estructurales a escala nanométrica se basan en células más grandes o los tejidos que se someten a este tipo de productos químicos agresivos – limitando así la interpretación de los hallazgos 4,9,25. Por otra parte, para la penetración del haz de electrones, se requiere de seccionamiento para los organismos o protuberancias celulares que presentan un espesor superior a 1 m 12. Finalmente, seccionada o blanqueado resultados de tejido en la colección de conjuntos de datos sobre el tramo específico discretas, lo que hace engorrosa la definición de la función alargada de neuritas. Incluso para la crio-EM, en la que el corte una muestra congelada hidratado es posible, el método introduce Artif compresiónHechos 1.
En los últimos años, los investigadores han aprendido cómo hacer crecer las neuronas del hipocampo directamente en redes de EM y el flash de congelación en etano líquido para visualizar posteriormente neuritas utilizando crio-ET 8,10,18,23. Sin embargo, tales estudios o bien utilizar un producto a medida 10,23, o los detalles de la falta en el paso de secante para la generación de hielo vítreo lo suficientemente delgada como para la visualización de rutina 8,18. Por ejemplo, un estudio recomienda el uso de 30 a 40 segundos para secar la rejilla EM 10, sin embargo, este valor no está optimizado para su uso general, pero es específica para ese dispositivo de inmersión congelación a medida. El uso de un producto a medida en lugar de un comercialmente disponible un 17 para el mantenimiento de la humedad antes de sumergirse de congelación de la muestra podría representar un obstáculo para la reproducibilidad generalizada.
Si bien estos estudios han sido pioneras en la visualización de neuritas por crio-ET, hemos dado un paso más para explorar la apaplicabilidad de la crio-ET a una variedad de especímenes neuronales (neuronas del hipocampo y del ganglio de la raíz dorsal). Además, se discuten tanto los resultados óptimos y subóptimos, así como los posibles artefactos que uno podría encontrar utilizando la crio-ET para tales especímenes.
Definición de una técnica detallada para la preservación y la visualización de las neuritas enteros a escala nanométrica en un estado casi nativo aumentaría la capacidad de más investigadores para llevar a cabo estudios ultraestructurales. Para ello, se describe un protocolo eficaz y detallada utilizando equipos disponibles comercialmente para preparar, neuronas no marcadas no fijadas para visualizar las neuritas. Este es un importante primer paso hacia la que detalla la ultraestructura de neuritas saludables y para sentar las bases para la comprensión de cuáles son las diferencias estructurales presentes en modelos de enfermedades del sistema nervioso. Desde crio-ET puede resolver, las características de neuritas sin teñir no fijadas en 3-D en la escala nanométrica, el método hará posible que nunca seatanto para definir la arquitectura neurítico 12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se demuestra que las neuronas embrionarias de rata (ganglio de la raíz dorsal y del hipocampo) que se puede cultivar en el microscopio electrónico de oro (EM) rejillas y congelado en hielo vítreo lo suficientemente delgada como para sus neuritas para ser fotografiados utilizando 2-D crio-EM y 3-D de la crio- ET. Mientras neuritas hipocampo previamente han sido fotografiadas usando crio-ET 8,10,18,23, un protocolo lo suficientemente detallada para la replicación exitosa utilizando dispositivos disponibles …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación ha sido apoyada por las subvenciones del NIH (PN2EY016525 y P41GM103832). SHS fue apoyado por una beca del Programa de Postgrado de Formación Nanobiología Interdisciplinario del Centro WM Keck Interdisciplinarias Bioscience Formación de la Costa del Golfo de Consorcios (NIH Grant N º T32EB009379).
SHS disecado, creció y DRG y las células del hipocampo vitrificada; recolectó datos crio-ET de DRG y axones del hipocampo crio-EM y, reconstruido y color anotado la serie de inclinación. MRG disecada y proporcionó las células del hipocampo en el laboratorio del MNR. SC asistido en la anotación serie inclinación. SHS fue entrenado por CW sobre la forma de diseccionar y crecer neuronas. SHS, WCM y WC concibieron los experimentos. SHS preparado el manuscrito con el aporte de otros autores.
Este video fue filmado en el Centro de la Imagen y Celular NanoAnalytics (C-CINA) del Biozentrum de tque la Universidad de Basilea. C-CINA se integra en el Departamento de Ciencia e Ingeniería de Biosistemas (D-BSSE) de la ETH Zürich, ubicado en Basilea, Suiza.
Materials
| Dumont #7 Tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72803-01 | For handling EM grids |
| Glass bottom dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-10C | For growing sample |
| Electron microscopy grids | Quantifoil | Holey Carbon, Au 200, R 2/2 | For growing sample |
| Calcium-free filter paper | Whatman | 1541-055 | For blotting sample |
| Large flat point long tweezers | Excelta Corporation | E003-000590, 25-SA | For blotting sample |
| Vitrification device and tweezers | FEI | Vitrobot Mark III | For freezing sample |
| Mini grid storage boxes | Ted Pella, Inc. | 160-40 | For storing EM grids |
| Cryo transfer holder | Gatan | 626 Single Tilt Liquid Nitrogen Cryo Transfer Holder | For imaging samples |
| Semi-automated tilt series acquisition software | SerialEM | http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | For imaging samples |
| Image processing software | IMOD eTomo | http://bio3d.colorado.edu/imod/ | For image processing |
| Transmission electron microscope for cryoEM | JEOL, Tokyo | 200-kV JEM2100 LaB6 electron microscope | For imaging samples |
| 4k x 4k CCD camera | Gatan | N/A | For imaging samples |
| 3-D annotation software | Visage Imaging GmbH | Amira/Avizo | For processing 3-D data |
| Software for digitally stitching 2-D images | Adobe | Adobe Photoshop | For processing 2-D data |
| DMEM, High Glucose | Invitrogen | 11965-118 | For hippocampal culture |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B-0252 | For hippocampal culture |
| Sodium tetraborate | Sigma Aldrich | B-9876 | For hippocampal culture |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P2636-500MG | For hippocampal culture |
| Filter system | Corning | 430758 | For hippocampal culture |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | For DRG culture |
| B-27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | For DRG culture |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | For DRG culture |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | For DRG culture |
| Recombinant rat b-NGF | R&D Systems | 556-NG | For DRG culture |
| Uridine | Sigma | U3003-5G | For DRG culture |
| 5'-Fluoro-2'-deoxyuridine | Sigma | F0503-100MG | For DRG culture |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | For DRG culture |
References
- Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. EMBO J. 23, 3583-3588 (2004).
- Benzing, W. C., Mufson, E. J., Armstrong, D. M. Alzheimer’s disease-like dystrophic neurites characteristically associated with senile plaques are not found within other neurodegenerative diseases unless amyloid beta-protein deposition is present. Brain Res. 606, 10-18 (1993).
- Binks, B. P. . Modern characterization methods of surfactant systems. , (1999).
- Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr. Opin. Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
- Chen, S., et al. Electron cryotomography of bacterial cells. J. Vis. Exp. (39), e1943 (2010).
- DiFiglia, M., et al. Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain. Science. 277, 1990-1993 (1997).
- Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W. Frozen aqueous suspensions. Ultramicroscopy. 10, 55-61 (1982).
- Fernández-Busnadiego, R., et al. Insights into the molecular organization of the neuron by cryo-electron tomography. J. Electron Microsc. 60, 137-148 (2011).
- Frey, T. G., Perkins, G. A., Ellisman, M. H. Electron tomography of membrane-bound cellular organelles. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 199-224 (2006).
- Garvalov, B. K., et al. Luminal particles within cellular microtubules. J. Cell. Biol. 174, 759-765 (2006).
- Grünewald, K., Cyrklaff, M. Structure of complex viruses and virus-infected cells by electron cryo tomography. Curr. Opin. Microbiol. 9, 437-442 (2006).
- Gu, J., Bourne, P. E. . Structural bioinformatics. , (2009).
- De Hoop, M. J., Meyn, L., Dotti, C. G. Culturing hippocampal neurons and astrocytes from fetal rodent brain. Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, (1998).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
- Fink, C. C., et al. Selective regulation of neurite extension and synapse formation by the beta but not the alpha isoform of CaMKII. Neuron. 39, 283-297 (2003).
- Jacob, W. A., et al. Mitochondrial matrix granules: their behavior during changing metabolic situations and their relationship to contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Microsc. Res. Tech. 27, 307-318 (1994).
- Jensen, G. J., Briegel, A. How electron cryotomography is opening a new window onto prokaryotic ultrastructure. Curr. Opin. Struct. Biol. 17, 260-267 (2007).
- Ibiricu, I., et al. Cryo Electron Tomography of Herpes Simplex Virus during Axonal Transport and Secondary Envelopment in Primary Neurons. PLoS Pathog. 7, e1002406 (2011).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Koning, R. I., et al. Cryo electron tomography of vitrified fibroblasts: microtubule plus ends in situ. J. Struct. Biol. 161, 459-468 (2008).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).
- Lotharius, J., Brundin, P. Pathogenesis of Parkinson’s disease: dopamine, vesicles and alpha-synuclein. Nat. Rev. Neurosci. 3, 932-942 (2002).
- Lucić, V., et al. Multiscale imaging of neurons grown in culture: from light microscopy to cryo-electron tomography. J. Struct. Biol. 160, 146 (2007).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and. 2, 152-160 (2007).
- Marsh, B. J. Lessons from tomographic studies of the mammalian Golgi. Biochim. Biophys. Acta. 1744, 273-292 (2005).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J. Struct. Biol. 152, 36-51 (2005).
- Medalia, O., et al. Organization of actin networks in intact filopodia. Curr. Biol. 17, 79-84 (2007).
- Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298, 1209-1213 (2002).
- Meyerson, J. R., et al. Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging. J. Vis. Exp. (58), e2770 (2011).
- Nakatomi, H., et al. Regeneration of Hippocampal Pyramidal Neurons after Ischemic Brain Injury by Recruitment of Endogenous Neural Progenitors. Cell. 110, 429-441 (2002).
- Peachey, L. D. Electron Microscopic Observations on the Accumulation of Divalent Cations in Intramitochondrial Granules. J. Cell. Biol. 20, 95-111 (1964).
- Raza, M., et al. Aging is associated with elevated intracellular calcium levels and altered calcium homeostatic mechanisms in hippocampal neurons. Neurosci. Lett. 418, 77-81 (2007).
- Scroggs, R. S., Fox, A. P. Calcium current variation between acutely isolated adult rat dorsal root ganglion neurons of different size. J. Physiol. 445, 639-658 (1992).
- Squire, L. R. . Fundamental neuroscience. , (2003).
- Sulzer, D. Multiple hit hypotheses for dopamine neuron loss in Parkinson’s disease. Trends Neurosci. 30, 244-250 (2007).
- Tapia, J. C., et al. Early expression of glycine and GABA(A) receptors in developing spinal cord neurons. Effects on neurite outgrowth. 신경과학. 108, 493-506 (2001).
