Udarbejdelse af Primary neuroner til visualisering neurites i frossen hydreret tilstand vha. Cryo-Electron Tomography
Summary
For at bevare neuronale processer til ultrastrukturelle analyse beskriver vi en protokol til galvanisering af primære neuroner på elektronmikroskopi gitre efterfulgt af flash frysning, hvilket giver prøver suspenderet i et lag af glasagtig is. Disse prøver kan undersøges med en cryo-elektron mikroskop til at visualisere strukturer på nanometer skala.
Abstract
Neurites begge dendritter og axoner, er neuronale cellulære processer, der muliggør overledning af elektriske impulser mellem neuroner. Definere strukturen i neurites er afgørende for at forstå, hvordan disse processer flytter materialer og signaler, der understøtter synaptiske kommunikation. Elektronmikroskopi (EM) traditionelt har været anvendt til at vurdere de ultrastrukturelle funktioner inden neuritter, men kan eksponeringen for organisk opløsningsmiddel under dehydrering og harpiks indlejring fordreje strukturer. Et vigtigt udækket mål er udarbejdelse af procedurer, der giver mulighed for strukturelle evalueringer ikke påvirket af sådanne artefakter. Her har vi etableret et detaljeret og reproducerbar protokol for voksende og flash-frysning hele neurites af forskellige primære neuroner på elektronmikroskopi gitre efterfulgt af deres eksamen med cryo-elektron tomografi (cryo-ET). Denne teknik giver mulighed for 3-D visualisering af frosne, hydreret neurites på nanometer opløsning, lette Assessment af deres morfologiske forskelle. Vores protokol giver en hidtil uset udsigt over Dorsalrodsganglieceller (DRG) neuriter, og en visualisering af hippocampus neurites i deres nær-native tilstand. Som sådan disse metoder skaber et fundament for fremtidige undersøgelser af neuritter på både normale neuroner og dem påvirket af neurologiske lidelser.
Introduction
Neuroner etablere komplekse kredsløb afgørende for funktionen af det centrale og perifere nervesystem ved at udarbejde dendritter at modtage oplysninger og axoner, ofte ganske langvarige, til at kommunikere med downstream neuroner. Neuritudvækst spiller en afgørende rolle under fosterudviklingen og neuronal differentiering og vedligeholdelse af neuritter understøtter kritisk funktionen af nervesystemet. Neuritisk processer også kritisk i neuronal skade og regenerering, samt sygdomme i nervesystemet. Studiet af neuronal arkitektur er afgørende at forstå både den normale og sygdomsramte hjerne. Heldigvis findes fysiologisk relevante neuronale cellekultur systemer, der kan gentage komplekse og heterogene cellulære strukturer. Baseret på opklaringen af solide eksperimentelle platforme, effektive visualisering strategier, der muliggør kvalitative og kvantitative analyser af neuronal morfologi er nødvendige. Især nyttigt villevære en detaljeret metode, der giver en ensartet platform til visualisering neurites, både axoner og dendritter på nanometer skala.
Traditionel elektronmikroskopi kræver brug af organiske opløsningsmidler under dehydrering og harpiks indlejring, hvilket kan fremkalde fordrejninger i prøver fra deres sande tilstand. Til dato, er de fleste strukturelle karakteriseringer på nanometer skala baseret på større celler eller væv, der udsættes for sådanne skrappe kemikalier – og dermed begrænser fortolkningen af resultaterne 4,9,25. Desuden, for elektronstråle penetration, er sektionering kræves for organismer eller cellulære fremspring udviser en tykkelse større end 1 um 12. Endelig snit eller sleben væv resulterer i samling af diskrete skive-specifikke datasæt, hvilket gør besværlig definitionen af det aflange element i neuritter. Selv for cryo-EM, hvor sektionering en frossen hydreret eksemplar er muligt metoden introducerer kompression Artifretsakter 1..
I de senere år har forskere lært at dyrke hippocampusneuroner direkte på EM net og flash-frysning dem i flydende ethan efterfølgende visualisere neurites hjælp cryo-ET 8,10,18,23. Sådanne undersøgelser, enten Dog bruge en specialfremstillet anordning 10,23, eller mangel detaljer om blotting trin til at generere tynd nok glasagtige is til rutinemæssig visualisering 8,18. For eksempel er en undersøgelse anbefaler brug af 30-40 sek duppe EM gitteret 10, men er denne værdi optimeres ikke til almindelig brug, men er specifik for at skræddersyet dyk-frysning enhed. Ved hjælp af en skræddersyet enhed snarere end en kommercielt tilgængelig en 17 for at opretholde fugtighed før at styrte-frysning af prøven kan udgøre en forhindring for udbredt reproducerbarhed.
Mens disse undersøgelser er banebrydende i at visualisere neurites ved cryo-ET, har vi taget et skridt videre for at udforske APplicability af cryo-ET til en række af neuronale prøver (hippocampus og Dorsalrodsganglieceller neuroner). Derudover diskuterer vi både optimale og suboptimale resultater, såvel som de potentielle artefakter, som man kan støde på ved hjælp af cryo-ET for sådanne prøver.
Definition af en detaljeret teknik til konservering og visualisere hele neurites på nanometer skala i en nær-indfødt stat ville forbedre muligheden for flere forskere til at udføre ultrastrukturelle studier. Til dette formål beskriver vi en effektiv og detaljeret protokol under anvendelse af kommercielt tilgængeligt udstyr til fremstilling af fikserede ufarvede neuroner til at visualisere neuritter. Dette er et vigtigt første skridt i retning af detaljering ultrastruktur sunde neurites og at lægge fundamentet for at forstå, hvad strukturelle forskelle er til stede i nervesystem modeller. Da cryo-ET kan løse ufikserede, ufarvede neuritlængder funktioner i 3-D på nanometer skala, vil metoden gøre det muligt, da aldrig værederfor at definere neuritisk arkitektur 12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi viser, at rotte embryonale neuroner (Dorsalrodsganglieceller og hippocampus) kan dyrkes på guld-elektronmikroskopi (EM) net og frosset i glaslegemet is tynd nok for deres neuritter, der skal afbildes ved hjælp af 2-D cryo-EM og 3-D cryo- ET. Mens hippocampus neurites tidligere har været filmede med cryo-ET 8,10,18,23, en protokol detaljeret nok for en vellykket replikation ved hjælp kommercielt tilgængelige enheder har manglet. Desuden mens deres forskning har været banebrydende brug af cryo-ET til a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning er blevet støttet af NIH tilskud (PN2EY016525 og P41GM103832). SHS blev støttet af et stipendium fra nanobiology Interdisciplinary Graduate Training Program af WM Keck Center for Tværfaglig Bioscience Træning af Gulf Coast konsortier (NIH Grant No T32EB009379).
SHS dissekeret, voksede og forglasset DRG og hippocampus celler opsamlet cryo-EM og cryo-ET data for DRG og hippocampus axoner, rekonstrueret og farve-kommenteret tilt-serien. MRG dissekeret og billede hippocampusceller i MNR laboratorium. SC bistået i tilt-serien anmærkning. SHS blev trænet af CW om, hvordan man dissekere og vokse neuroner. SHS, WCM og toilet udtænkt forsøgene. SHS udarbejdet manuskriptet med input fra andre forfattere.
Denne video blev filmet på Center for Cellulær Imaging og NanoAnalytics (C-CINA) i Biozentrum af than University Basel. C-CINA er integreret i afdelingen for Biosystemer Science and Engineering (D-BSSE) i ETH Zürich, der ligger i Basel, Schweiz.
Materials
| Dumont #7 Tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72803-01 | For handling EM grids |
| Glass bottom dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-10C | For growing sample |
| Electron microscopy grids | Quantifoil | Holey Carbon, Au 200, R 2/2 | For growing sample |
| Calcium-free filter paper | Whatman | 1541-055 | For blotting sample |
| Large flat point long tweezers | Excelta Corporation | E003-000590, 25-SA | For blotting sample |
| Vitrification device and tweezers | FEI | Vitrobot Mark III | For freezing sample |
| Mini grid storage boxes | Ted Pella, Inc. | 160-40 | For storing EM grids |
| Cryo transfer holder | Gatan | 626 Single Tilt Liquid Nitrogen Cryo Transfer Holder | For imaging samples |
| Semi-automated tilt series acquisition software | SerialEM | http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | For imaging samples |
| Image processing software | IMOD eTomo | http://bio3d.colorado.edu/imod/ | For image processing |
| Transmission electron microscope for cryoEM | JEOL, Tokyo | 200-kV JEM2100 LaB6 electron microscope | For imaging samples |
| 4k x 4k CCD camera | Gatan | N/A | For imaging samples |
| 3-D annotation software | Visage Imaging GmbH | Amira/Avizo | For processing 3-D data |
| Software for digitally stitching 2-D images | Adobe | Adobe Photoshop | For processing 2-D data |
| DMEM, High Glucose | Invitrogen | 11965-118 | For hippocampal culture |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B-0252 | For hippocampal culture |
| Sodium tetraborate | Sigma Aldrich | B-9876 | For hippocampal culture |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P2636-500MG | For hippocampal culture |
| Filter system | Corning | 430758 | For hippocampal culture |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | For DRG culture |
| B-27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | For DRG culture |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | For DRG culture |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | For DRG culture |
| Recombinant rat b-NGF | R&D Systems | 556-NG | For DRG culture |
| Uridine | Sigma | U3003-5G | For DRG culture |
| 5'-Fluoro-2'-deoxyuridine | Sigma | F0503-100MG | For DRG culture |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | For DRG culture |
References
- Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. EMBO J. 23, 3583-3588 (2004).
- Benzing, W. C., Mufson, E. J., Armstrong, D. M. Alzheimer’s disease-like dystrophic neurites characteristically associated with senile plaques are not found within other neurodegenerative diseases unless amyloid beta-protein deposition is present. Brain Res. 606, 10-18 (1993).
- Binks, B. P. . Modern characterization methods of surfactant systems. , (1999).
- Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr. Opin. Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
- Chen, S., et al. Electron cryotomography of bacterial cells. J. Vis. Exp. (39), e1943 (2010).
- DiFiglia, M., et al. Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain. Science. 277, 1990-1993 (1997).
- Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W. Frozen aqueous suspensions. Ultramicroscopy. 10, 55-61 (1982).
- Fernández-Busnadiego, R., et al. Insights into the molecular organization of the neuron by cryo-electron tomography. J. Electron Microsc. 60, 137-148 (2011).
- Frey, T. G., Perkins, G. A., Ellisman, M. H. Electron tomography of membrane-bound cellular organelles. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 199-224 (2006).
- Garvalov, B. K., et al. Luminal particles within cellular microtubules. J. Cell. Biol. 174, 759-765 (2006).
- Grünewald, K., Cyrklaff, M. Structure of complex viruses and virus-infected cells by electron cryo tomography. Curr. Opin. Microbiol. 9, 437-442 (2006).
- Gu, J., Bourne, P. E. . Structural bioinformatics. , (2009).
- De Hoop, M. J., Meyn, L., Dotti, C. G. Culturing hippocampal neurons and astrocytes from fetal rodent brain. Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, (1998).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
- Fink, C. C., et al. Selective regulation of neurite extension and synapse formation by the beta but not the alpha isoform of CaMKII. Neuron. 39, 283-297 (2003).
- Jacob, W. A., et al. Mitochondrial matrix granules: their behavior during changing metabolic situations and their relationship to contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Microsc. Res. Tech. 27, 307-318 (1994).
- Jensen, G. J., Briegel, A. How electron cryotomography is opening a new window onto prokaryotic ultrastructure. Curr. Opin. Struct. Biol. 17, 260-267 (2007).
- Ibiricu, I., et al. Cryo Electron Tomography of Herpes Simplex Virus during Axonal Transport and Secondary Envelopment in Primary Neurons. PLoS Pathog. 7, e1002406 (2011).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Koning, R. I., et al. Cryo electron tomography of vitrified fibroblasts: microtubule plus ends in situ. J. Struct. Biol. 161, 459-468 (2008).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).
- Lotharius, J., Brundin, P. Pathogenesis of Parkinson’s disease: dopamine, vesicles and alpha-synuclein. Nat. Rev. Neurosci. 3, 932-942 (2002).
- Lucić, V., et al. Multiscale imaging of neurons grown in culture: from light microscopy to cryo-electron tomography. J. Struct. Biol. 160, 146 (2007).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and. 2, 152-160 (2007).
- Marsh, B. J. Lessons from tomographic studies of the mammalian Golgi. Biochim. Biophys. Acta. 1744, 273-292 (2005).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J. Struct. Biol. 152, 36-51 (2005).
- Medalia, O., et al. Organization of actin networks in intact filopodia. Curr. Biol. 17, 79-84 (2007).
- Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298, 1209-1213 (2002).
- Meyerson, J. R., et al. Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging. J. Vis. Exp. (58), e2770 (2011).
- Nakatomi, H., et al. Regeneration of Hippocampal Pyramidal Neurons after Ischemic Brain Injury by Recruitment of Endogenous Neural Progenitors. Cell. 110, 429-441 (2002).
- Peachey, L. D. Electron Microscopic Observations on the Accumulation of Divalent Cations in Intramitochondrial Granules. J. Cell. Biol. 20, 95-111 (1964).
- Raza, M., et al. Aging is associated with elevated intracellular calcium levels and altered calcium homeostatic mechanisms in hippocampal neurons. Neurosci. Lett. 418, 77-81 (2007).
- Scroggs, R. S., Fox, A. P. Calcium current variation between acutely isolated adult rat dorsal root ganglion neurons of different size. J. Physiol. 445, 639-658 (1992).
- Squire, L. R. . Fundamental neuroscience. , (2003).
- Sulzer, D. Multiple hit hypotheses for dopamine neuron loss in Parkinson’s disease. Trends Neurosci. 30, 244-250 (2007).
- Tapia, J. C., et al. Early expression of glycine and GABA(A) receptors in developing spinal cord neurons. Effects on neurite outgrowth. 신경과학. 108, 493-506 (2001).
