Utarbeidelse av Primary nevroner for å visualisere neurites i en Frozen hydrert tilstand ved hjelp av Cryo-Electron Tomography
Summary
For å opprettholde neuronal prosesser for ultra analyse, beskriver vi en protokoll for plettering av primære nerveceller for elektronmikroskopi gittere etterfulgt av flash-frysing, hvilket ga prøvene suspendert i et lag av glasslegemet is. Disse prøvene kan undersøkes med en Cryo-elektronmikroskop for å visualisere strukturer på nanometer skala.
Abstract
Neurites, både dendritter og aksoner, er nevronale cellulære prosesser som muliggjør gjennomføring av elektriske impulser mellom nerveceller. Definere strukturen av neurites er avgjørende for å forstå hvordan disse prosessene flytte materialer og signaler som støtter synaptisk kommunikasjon. Elektronmikroskopi (EM) har tradisjonelt blitt brukt til å vurdere de ultra funksjoner innen neurites, men kan eksponering for organiske løsemidler i løpet av dehydrering og harpiks embedding forvrenge strukturer. Et viktig udekket mål er utformingen av prosedyrer som gir mulighet for strukturelle evalueringer ikke påvirket av slike gjenstander. Her har vi etablert en detaljert og reproduserbar protokoll for dyrking og flash-frysing hele neurites av ulike primære nevroner på elektronmikros nett etterfulgt av sin undersøkelse med cryo-electron tomography (cryo-ET). Denne teknikken gjør det mulig for 3-D visualisering av frosne, hydrerte neurites på nanometer-oppløsning, tilrettelegging assevurdering av sine morfologiske forskjeller. Vår protokollen gir en enestående utsikt over dorsal root ganglion (DRG) neurites, og en visualisering av hippocampus neurites i sin tilnærmet opprinnelig tilstand. Som sådan, disse metodene skape et grunnlag for fremtidige studier på neurites av både normale nerveceller og de påvirket av nevrologiske lidelser.
Introduction
Nerveceller etablere komplekse kretsene viktig for funksjonen av det sentrale og perifere nervesystem ved å utarbeide dendritter å motta informasjon og aksoner, ofte ganske lang, for å kommunisere med nedstrøms nevroner. Neurite utvekst spiller en fundamental rolle under embryonal utvikling og neuronal differensiering og vedlikehold av neurites støtter kritisk funksjon i nervesystemet. Neuritic prosesser også kritisk i nevronale skader og regenerering, samt nervesystemet lidelser. Studiet av neuronal arkitekturen er viktig å forstå både normalt og sykt hjernen. Heldigvis, fysiologisk relevante nevronale cellekultursystemer finnes som kan rekapitulere komplekse og heterogene cellulære strukturer. Basert på klarlegging av faste eksperimentelle plattformer, effektive visualiseringsstrategier som gjør at kvalitative og kvantitative analyser av neuronal morfologi er nødvendig. Spesielt nyttig villevære en detaljert metodikk som gir en konsistent plattform for å visualisere neurites, både axoner og dendritter på nanometer skala.
Tradisjonelle elektronmikros krever bruk av organisk oppløsningsmiddel under dehydrering og harpiks innebygging, som kan fremkalle forstyrrelser i prøvene fra sin sanne tilstand. Til dags dato, er de fleste strukturelle karakteristikker på nanometer skala basert på større celler eller vev som er utsatt for slike sterke kjemikalier – og dermed begrense tolkningen av funnene 4,9,25. Videre, for elektronstrålegjennomtrengning, er snitte kreves for organismer eller cellulære fremspring som oppviser en tykkelse som er større enn 1 mikrometer 12.. Til slutt, seksjonert eller oppmalt vev resulterer i samling av diskrete stykkespesifikke datasett, slik tungvint definisjonen av den langstrakte trekk ved neurites. Selv for cryo-EM, der seksjonering en frossen hydrert prøven er mulig, introduserer metoden komprimering Artifopptrer en.
I de senere årene har forskere lært å vokse hippocampus nevroner direkte på EM nett og flash-fryse dem i flytende etan til senere å visualisere neurites hjelp cryo-ET 8,10,18,23. Men slike studier enten bruke en skreddersydd enhet 10,23, eller mangel detaljer om blotting skritt for å generere tynn nok glasslegemet isen for rutine visualisering 8,18. For eksempel anbefaler en studie på bruk av 30-40 sek for blotting EM grid 10, men er denne verdien optimalisert ikke for generell bruk, men er spesifikk for at skreddersydde stupe-frysing enhet. Ved hjelp av en skreddersydd enhet snarere enn et kommersielt tilgjengelig en 17 for å opprettholde fuktighet før stupe-frysing prøven kunne utgjøre et hinder for utbredt reproduserbarhet.
Mens disse studiene har vært banebrytende i å visualisere neurites av Cryo-ET, har vi tatt et skritt videre for å utforske applicability av cryo-ET til en rekke nevrale prøver (hippocampus og dorsal root ganglion nevroner). I tillegg diskuterer vi både optimale og suboptimale resultater, samt de potensielle gjenstander som man kunne støte på ved bruk cryo-ET for slike prøver.
Definere en detaljert teknikk for å bevare og visualisere hele neurites på nanometer skala i en tilnærmet opprinnelig tilstand ville styrke muligheten for flere forskere å utføre ultra studier. For å oppnå dette, beskriver vi en effektiv og detaljert protokollen med kommersielt tilgjengelig utstyr for å forberede ufestede, ufargede nevroner å visualisere neurites. Dette er et viktig første skritt mot detaljering ultrastructure av sunne neurites og å legge grunnlaget for å forstå hva slags strukturelle forskjellene er til stede i nervesystemet sykdom modeller. Siden Cryo-ET kan løse ufestede, ufargede neurite funksjoner i 3-D på nanometer skala, vil metoden gjør det mulig som aldri værederfor å definere neuritic arkitektur 12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi viser at rotte embryonale nevroner (dorsal root ganglion og hippocampus) kan dyrkes på gull elektronmikroskopi (EM) rutenett og frosset i glasslegemet isen tynn nok for deres neurites å bli fotografert ved hjelp av 2-D cryo-EM og 3-D cryo- ET. Mens hippocampus neurites har tidligere blitt fotografert ved hjelp av cryo-ET 8,10,18,23, en protokoll detaljert nok for vellykket replikering ved hjelp av kommersielt tilgjengelige enheter har vært mangelfull. Videre, mens deres forskning har pioner bruk av kryo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen har vært støttet av NIH tilskudd (PN2EY016525 og P41GM103832). SHS ble støttet av et fellesskap fra Biology Tverrfaglig Graduate Training Program av WM Keck Center for Tverrfaglig Biovitenskap Opplæring av Gulf Coast konsortier (NIH Grant No T32EB009379).
SHS dissekert, vokste og forglassede DRG og hippocampus celler; samlet cryo-EM og cryo-ET data av DRG og hippocampus axoner, rekonstruert og farge-annotert tilt serien. MRG dissekert og ga hippocampus celler i MNR laboratorium. SC bistått i tilt serien merknad. SHS ble trent av CW på hvordan å dissekere og vokse nevroner. SHS, WCM og WC unnfanget forsøkene. SHS utarbeidet manuskriptet med innspill fra andre forfattere.
Denne videoen ble filmet ved Center for Cellular Imaging og NanoAnalytics (C-CINA) av Biozentrum av tHan Universitetet Basel. C-CINA er integrert i Avdeling for Biosystems Science and Engineering (D-BSSE) av ETH Zürich, som ligger i Basel, Sveits.
Materials
| Dumont #7 Tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72803-01 | For handling EM grids |
| Glass bottom dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-10C | For growing sample |
| Electron microscopy grids | Quantifoil | Holey Carbon, Au 200, R 2/2 | For growing sample |
| Calcium-free filter paper | Whatman | 1541-055 | For blotting sample |
| Large flat point long tweezers | Excelta Corporation | E003-000590, 25-SA | For blotting sample |
| Vitrification device and tweezers | FEI | Vitrobot Mark III | For freezing sample |
| Mini grid storage boxes | Ted Pella, Inc. | 160-40 | For storing EM grids |
| Cryo transfer holder | Gatan | 626 Single Tilt Liquid Nitrogen Cryo Transfer Holder | For imaging samples |
| Semi-automated tilt series acquisition software | SerialEM | http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | For imaging samples |
| Image processing software | IMOD eTomo | http://bio3d.colorado.edu/imod/ | For image processing |
| Transmission electron microscope for cryoEM | JEOL, Tokyo | 200-kV JEM2100 LaB6 electron microscope | For imaging samples |
| 4k x 4k CCD camera | Gatan | N/A | For imaging samples |
| 3-D annotation software | Visage Imaging GmbH | Amira/Avizo | For processing 3-D data |
| Software for digitally stitching 2-D images | Adobe | Adobe Photoshop | For processing 2-D data |
| DMEM, High Glucose | Invitrogen | 11965-118 | For hippocampal culture |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B-0252 | For hippocampal culture |
| Sodium tetraborate | Sigma Aldrich | B-9876 | For hippocampal culture |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P2636-500MG | For hippocampal culture |
| Filter system | Corning | 430758 | For hippocampal culture |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | For DRG culture |
| B-27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | For DRG culture |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | For DRG culture |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | For DRG culture |
| Recombinant rat b-NGF | R&D Systems | 556-NG | For DRG culture |
| Uridine | Sigma | U3003-5G | For DRG culture |
| 5'-Fluoro-2'-deoxyuridine | Sigma | F0503-100MG | For DRG culture |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | For DRG culture |
References
- Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. EMBO J. 23, 3583-3588 (2004).
- Benzing, W. C., Mufson, E. J., Armstrong, D. M. Alzheimer’s disease-like dystrophic neurites characteristically associated with senile plaques are not found within other neurodegenerative diseases unless amyloid beta-protein deposition is present. Brain Res. 606, 10-18 (1993).
- Binks, B. P. . Modern characterization methods of surfactant systems. , (1999).
- Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr. Opin. Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
- Chen, S., et al. Electron cryotomography of bacterial cells. J. Vis. Exp. (39), e1943 (2010).
- DiFiglia, M., et al. Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain. Science. 277, 1990-1993 (1997).
- Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W. Frozen aqueous suspensions. Ultramicroscopy. 10, 55-61 (1982).
- Fernández-Busnadiego, R., et al. Insights into the molecular organization of the neuron by cryo-electron tomography. J. Electron Microsc. 60, 137-148 (2011).
- Frey, T. G., Perkins, G. A., Ellisman, M. H. Electron tomography of membrane-bound cellular organelles. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 199-224 (2006).
- Garvalov, B. K., et al. Luminal particles within cellular microtubules. J. Cell. Biol. 174, 759-765 (2006).
- Grünewald, K., Cyrklaff, M. Structure of complex viruses and virus-infected cells by electron cryo tomography. Curr. Opin. Microbiol. 9, 437-442 (2006).
- Gu, J., Bourne, P. E. . Structural bioinformatics. , (2009).
- De Hoop, M. J., Meyn, L., Dotti, C. G. Culturing hippocampal neurons and astrocytes from fetal rodent brain. Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, (1998).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
- Fink, C. C., et al. Selective regulation of neurite extension and synapse formation by the beta but not the alpha isoform of CaMKII. Neuron. 39, 283-297 (2003).
- Jacob, W. A., et al. Mitochondrial matrix granules: their behavior during changing metabolic situations and their relationship to contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Microsc. Res. Tech. 27, 307-318 (1994).
- Jensen, G. J., Briegel, A. How electron cryotomography is opening a new window onto prokaryotic ultrastructure. Curr. Opin. Struct. Biol. 17, 260-267 (2007).
- Ibiricu, I., et al. Cryo Electron Tomography of Herpes Simplex Virus during Axonal Transport and Secondary Envelopment in Primary Neurons. PLoS Pathog. 7, e1002406 (2011).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Koning, R. I., et al. Cryo electron tomography of vitrified fibroblasts: microtubule plus ends in situ. J. Struct. Biol. 161, 459-468 (2008).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).
- Lotharius, J., Brundin, P. Pathogenesis of Parkinson’s disease: dopamine, vesicles and alpha-synuclein. Nat. Rev. Neurosci. 3, 932-942 (2002).
- Lucić, V., et al. Multiscale imaging of neurons grown in culture: from light microscopy to cryo-electron tomography. J. Struct. Biol. 160, 146 (2007).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and. 2, 152-160 (2007).
- Marsh, B. J. Lessons from tomographic studies of the mammalian Golgi. Biochim. Biophys. Acta. 1744, 273-292 (2005).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J. Struct. Biol. 152, 36-51 (2005).
- Medalia, O., et al. Organization of actin networks in intact filopodia. Curr. Biol. 17, 79-84 (2007).
- Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298, 1209-1213 (2002).
- Meyerson, J. R., et al. Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging. J. Vis. Exp. (58), e2770 (2011).
- Nakatomi, H., et al. Regeneration of Hippocampal Pyramidal Neurons after Ischemic Brain Injury by Recruitment of Endogenous Neural Progenitors. Cell. 110, 429-441 (2002).
- Peachey, L. D. Electron Microscopic Observations on the Accumulation of Divalent Cations in Intramitochondrial Granules. J. Cell. Biol. 20, 95-111 (1964).
- Raza, M., et al. Aging is associated with elevated intracellular calcium levels and altered calcium homeostatic mechanisms in hippocampal neurons. Neurosci. Lett. 418, 77-81 (2007).
- Scroggs, R. S., Fox, A. P. Calcium current variation between acutely isolated adult rat dorsal root ganglion neurons of different size. J. Physiol. 445, 639-658 (1992).
- Squire, L. R. . Fundamental neuroscience. , (2003).
- Sulzer, D. Multiple hit hypotheses for dopamine neuron loss in Parkinson’s disease. Trends Neurosci. 30, 244-250 (2007).
- Tapia, J. C., et al. Early expression of glycine and GABA(A) receptors in developing spinal cord neurons. Effects on neurite outgrowth. 신경과학. 108, 493-506 (2001).
