이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

교양있는 세포 기관 전송 초파리 셀 : S2 세포주 및 기본 뉴런.

13.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/50838

⸱

2013년 11월 20일

 ,  , 
1Department of Cell and Molecular Biology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2IKERBASQUE, Basque Foundation for Science

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

초파리 S2 세포 배양 신경 세포가 생체 내에서 모터 구동 세포 기관 수송의 이미징을위한 좋은 시스템입니다. 여기에서 우리는 두 종류의 세포를 배양에 대한 자신의 이미징 및 교통 분석을 상세한 프로토콜을 설명합니다.

초록

초파리 S2 세포는 균일하게 편광 된 미세 소관으로 가득 어떠한 액틴 해중합 약물 형태 긴 측쇄 프로세스의 존재 커버 슬립에서 도금했다. 세포 기관은 미세 소관 모터에 의해 이러한 프로세스를 따라 이동합니다. 쉬운 유지 보수, RNAi를 매개 단백질 노크 다운 및 안정적인 세포 라인을 만들기위한 효율적인 절차와 높은 감도는 초파리 S2 세포에게 라이브 영상으로화물 운송을 연구하는 이상적인 모델 시스템을 확인합니다. 해리 초파리 배아로부터 배양 된 신경 세포의 축삭 차 수송 : S2 세포로 얻어진 결과는 더욱 더 생리학 관련 시스템에 적용될 수있다. 배양 된 신경 세포는 S2 프로세스와 매우 유사 번들 미세 소관, 가득 긴 신경 돌기 성장. 같은 S2 세포에서 배양 된 신경 세포 소기관이 세포 내 소기관 중 하나를 특정 형광 염료 또는 DNA에 의해 암호화 형광 세포 기관 마커를 사용하여 시각화 할 수있는 초기 배아에 주입 또는 transgen 표현IC는 파리. 따라서 소기관 수송 간단 리빙 이미징을 사용하여 유리 커버 슬립에서 배양 된 신경 세포에서 기록 될 수있다. 여기에서 우리는 초파리 S2 세포 및 기본 뉴런에화물 운송을 배양하고 시각화하는 절차에 대해 설명합니다. 우리는 이러한 프로토콜은화물 수송을 연구 실험실에 대한 두 시스템에 액세스 할 수 있도록 믿습니다.

서론

초파리 S2 세포는 많은 세포 과정을 공부 증가 인기를 얻고있다. 이러한 세포는 원래 OregonR 초파리 melanogaster의 트립신의 최종 단계의 배아로부터 얻어지는 1. 초파리 S2 세포가 다른 세포주에 비해 많은 장점을 제공 식세포와 같은 기능을 유지 하였다. 그들은 CO 2없이 25 ° C에서 배양하고, 가열 또는 가스 교환의 필요없이 상온에서 많은 시간 동안 몇 군데하실 수 있습니다. 더 중요한 것은, 초파리 S2 세포는 그 단백질의 고효율 최저를 허용 RNAi의 치료에 매우 민감하다. S2 세포는 높은 형질이며 안정적인 세포주는 또한 단백질의 안정 이소성 발현을 허용 미만 사주에서 선택 될 수있다. S2 세포는 일반적으로 하나 성장 느슨하게 연결된하지만 플라스크 또는 정지에 확산되지. 그들은 식물 렉틴 콩카와 프리 코트 커버 슬립에 확산하도록 유도 할 수있다navalin A (CONA). 확산 세포의 주변은 특히 얇은 때문에 살아있는 세포 현미경에 이상적입니다. S2 세포 배양, RNAi의 치료, 라이브 광 이미징 및 면역 염색에 대한 자세한 프로토콜은 문학 2,3에서 찾을 수 있습니다. 우리 연구실은. 같은 사이토 D로 F-액틴을 해중합 또는 끊고 마약, (CytoD)으로 처리 초파리 S2 세포가 균일하게 편광 미세 소관 4 가득 긴 프로세스를 성장 미세 소관 기반의화물 운송을 연구하는 모델 시스템으로 S2 세포를 채택했다 10, 그 미세 소관 배열에 따라화물의 움직임을 연구 할 수있는 이상적인 시스템을 만드는. 이러한 과정에서 전송의 다른 매개 변수 (. 즉 궤도의 길이, 속도, 방향성 등)을 쉽게 자동화 된 입자 추적 소프트웨어를 DiaTrack (Semasopht 사용하여 측정 할 수 있습니다 http://www.microscopy.info/Organization/Details/4423; 박사 . 파스칼 Vallotton : http://www.csiro.au/en/Organisation-Structure/Divisions/Mathematics-Informatics-and-Statistics/PascalVallotton.aspx # A4). 이러한 속성은 S2 세포에게 조직 배양 세포의 미세 소관을 따라화물 수송을 연구 매력적인 시스템을 확인합니다.

S2 세포에서의 파일럿 실험은 초파리 차 뉴런에서화물 운송 연구의 중요한 생리 학적 모델로 확장 될 수있다. S2 세포와 유사하게, 해리 된 배아로부터 배양 된 신경 세포는 염료와 같은 작은 분자 억제제에 대한 투과성 및 소기관 수송의 고해상도 실시간 이미징 실온에서 뉴런에서 수행 될 수있다. 다른 유전 적 배경을 가진 초파리를 사용하여, 우리는 녹아웃 (유전자 기능 상실 돌연변이)에 의해 기본 뉴런 유전자의 기능을 검사 할 수 있습니다, 최저 (dsRNA를 주입 또는 표현) 또는 자궁외 식 (유전자 변형 파리). 특히, CytoD 치료를 사용하여 액틴 필라멘트의 분열은 신경 돌기의 파생물을 방지하지 않는 대신 그들은 빠르게 성장하고, 따라서 우리는 미세 소관 depende를 공부할 수 있습니다굴지의 영향없이 CytoD 처리 된 신경 세포 NT 소기관 전송 11 필라멘트. 따라서, 기본의 연결을 문화는 생리 관련 시스템 (10, 12)에화물 운송을 연구 할 수있는 좋은 시스템을 만드는, 조직 배양 세포의 장점을 결합하고 유전자를 비행. 여러 가족 퇴행성 신경 질환에 의해 발생 또는화물 수송 결함 (예를 들면 파킨슨 병 (13)와 연관 될 수 있기 때문에, 헌팅턴 병 (14), 알츠하이머 병 (15, 16), 루게릭 병 / ALS 17 HMN7B 및 페리 증후군 18, 19, 및 척수 소뇌 실조증 유형 5/SCA5 20), 기본의 연결을 문화가 미세 소관 의존 전송에이 질병을 일으키는 특정 돌연변이의 효과 분석에 유용 할 수 있습니다.

마지막으로, 미세 소관에 의존하는 교통의 중요한 속성은 잘 포유 동물과 파리 사이에 보존되지만, 초파리 유전자 및 세포 배양 정상 및 병리학 적 상태에서 소기관 수송의 필수적인 측면을 연구하기위한 배양 된 초파리 세포의 사용을 정당화하는, 덜 비싸고 시간 소모적이다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

1. 초파리 S2 세포

  1. CONA 코팅 커버 슬립의 제조

    1. 세라믹 랙에 커버 슬립을 놓고 1 시간 동안 크롬산 침지을 씻어. [주의 : 크롬산은 부식성이 눈의 자극, 코, 목, 피부가 발생할 수 있습니다].
    2. 산을 완전히 세척 될 때까지 지속적으로 30 분 동안 dH보다 2 O를 실행 충분히 커버 슬립을 씻어.
    3. 하자의 coverslips 공기 건조하고 CONA 30 분 DH (2 O 0.5 ㎎ / ㎖ 용액)와 코트를.
    4. 15 분 dH보다 2 O와 커버 슬립을 씻어하고 그들에게 자연 건조시켜. CONA 코팅 coverslips는 1 개월까지 저장할 수 있습니다.

  2. 세포 도금

    1. S2 세포는 지수 적 실험에 필요한 세포의 수에 따라 T25 또는 T75의 cm 2 플라스크에서 성장하는 것을 허용한다.
    2. 혈구를 이용하여 세포 밀도를 계산. 추가 1 ㎖ 성장 M부드럽게 35mm 조직 문화 CONA 코팅 coverslip에와 요리, 그리고로 edium (예를 들어 곤충-익스프레스)는 요리에 ~ 1 × 10 5 세포를 전송합니다. 서로 다른 셀로부터의 프로세스들이 중첩되지 않기 때문에이 세포 밀도는 촬상에 적합하다.
    3. 즉시 (2.5 μM C​​ytoD의 최종 농도) 접시에 5 μM의 CytoD으로 1 ㎖ 매체를 추가 도금 후, 프로세스의 형성을 유도하기 위해. 촬영 전에 25 º C에서 최소 2 시간 동안 세포를 배양하여 프로세스의 전체 개발을 허용합니다.

2. 초파리 차 신경 세포 문화

  1. 신경 세포 배양을위한 준비

    1. (:, 5 ㎍ / ml의 인슐린, 100 ㎍ / ㎖의 페니실린, 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신, 10 ㎍ / ㎖의 테트라 사이클린 20 % 소 태아 혈청, 30 분 동안 55 º C에서 불 활성화 열 슈나이더의 매체로 보충) 초파리 신경 세포의 성장 매체를 준비합니다 . 이 SUPplemented 슈나이더의 매체는 6 개월 4 º C에 저장할 수 있습니다.
    2. Drosophila의 배아 (22.5 g 한천 12.0 g 자당 750 ML의 H 2 리터 플라스크에 2 O를 수집하기 위해 사과 주스 한천 유리 병을 준비, 20 ~ 25 분 동안 오토 클레이브는, 250 ml의 사과 주스를 추가하고 각 초파리에 ~ 10 ㎖를 부어 유리 병;) 응고 후,면 공 튜브를 연결하고 식품의 건조를 통해 방지하기 위해 플라스틱 음식 포장으로 유리 병 포장. 한천 병에 사과 주스는 4 주 동안 잘 밀봉 된 비닐 봉투에 4 º C에 저장할 수 있습니다.
    3. CONA와 코트 산 세척 25mm 원형 커버 슬립 (초파리 S2 세포에 대한 프로토콜 참조)를 10 ~ 15 분 동안 자외선 아래를 소독. 이러한 커버 슬립 개월 동안 저장 될 수있다.

  2. Drosophila의 배아 신경 세포의 배양

    1. 계속 성인 배아 F를 수집하기 전에 1-2일에 건조 효모 보충 사과 주스 한천 병 난다또는 신경 준비.
    2. 수집 일에, 수집 된 배아를 동기화하기 위해, 전송 성인 빛 1 시간 precollection에 대한 신선한 사과 주스 한천 유리 병에 날아 이러한 배아를 폐기합니다.
    3. 전송은 1 시간 동안 배아를 수집하고, 배아의 수율을 높이기 위해 어둠 속에서 모두 다른 시간에 다른 유리 병에 파리를 전송하고, 새로운 사과 주스 한천 유리 병에 파리.
    4. 사과 주스 한천 유리 병에서 파리 성충을 제거하고 배아 실내 온도 (4 ~ 6 시​​간짜리 배아 단계 9 ~ 11 사이)의 단계에 또 다른 4 시간 9 ~ 11 호를 개발하자.
    5. 유리 병에 물을 분출하고 (최소 10 배아는 하나의 좋은 신경 세포의 준비에 필요한) 작은 붓 사과 주스 한천의 배아를 풀어 배아를 제거합니다.
    6. 물을 배수 할 수있는 전송 피펫으로 100 μm의 나일론 메쉬 셀 스트레이너에 배아를 전송 (Drosophila의 배아 세척 버퍼, 0.4 % 염화나트륨, 0.03 % 트리톤의 전송 피펫을 사전 헹굼X-100).
    7. 작은 붓을 사용하여 여과기에서 배아를 수집하고, 1 ㎖ Drosophila의 배아 세척 (참고 : 페인트 브러시 또는 피펫 팁을 사용하는 한천 또는면 섬유를 청소)로 채워진 1.5 ml의 마이크로 튜브로 전송할 수 있습니다. 이 프로토콜에서, 1.5 ml의 마이크로 튜브는 일치하는 처분 할 수있는 펠릿 유와 함께 제공됩니다.
    8. Drosophila의 배아 세척 배에서 배아를 씻으십시오.
    9. 10 분 동안 신선한 1시 1분 상업 표백제 용액 및 95 % 에탄올에 배아를 Dechorionate [주의 : 표백제 자극 눈, 코, 목, 피부가 발생할 수 있습니다].
    10. 조직 문화 후드로 이동 한 보충 슈나이더의 매체에 배아 배를 세척한다.
    11. 배아와 튜브에 200 ~ 300 ㎕의 매체를두고 부드럽게 기계 (10-15X를 갈기) 70 % 에탄올로 소독 한 킴블 체이스 처분 할 수있는 펠릿 방앗 공이를 사용하여 dechorionated 배아를 떼어 놓다.
    12. 2 분, 그리고 TRA 20 XG에 균질 혼합물을 원심 분리기새로운 튜브에 뜨는 nsfer. [이 단계는 선택 사항입니다, 그것은 배아 파편을 제거하는 데 도움이됩니다]
    13. 세포 펠렛 2 분 550 XG에 뜨는을 원심 분리기.
    14. 2 분 550 XG에 다시 슈나이더의 중간 스핀 세포를 보충 500 μL에 펠렛을 재현 탁, 한 번 재 부유 - 회전주기를 반복합니다.
    15. 마지막으로 슈나이더의 매체를 보충 ~ 100 μL에 펠렛을 재현 탁하고 멸균 35mm 페트리 접시에 25mm CONA 코팅 커버 슬립에 세포를 접시. 세포 부착을 허용하기 위해 10 분 동안 배양한다.
    16. 부착 된 세포와 커버 슬립을 잠수함 5 μM C​​ytoD 보충 슈나이더의 배지 2 ㎖를 추가합니다.
    17. 촬영하기 전에 밤새 가습 25 º C의 배양기에서 접시를 품어.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

플랫 라운드 "팬케이크"모양 (그림 1A와 1C)에 CONA 코팅 coverslip에 확산에 부착 초파리 S2 세포. S2 세포 CytoD의 존재의 coverslips에 도금하고 2-3 시간 동안 확산을 허용하면 이들은 병렬 미세 소관 (도 1B 및 1D)로 채워진 얇고 긴 프로세스를 형성한다. 7을 플러스 끝이 미세 소관은 균일 한 극성이 있습니다. 초파리 S2 안정적 mCherry-튜 불린을 표현하는 시간 경과 형광 이미징 프로세스, 특히 첨부 후 첫 60 분 (그림 2) 중, 매우 역동적 인 것을 보여줍니다. 1 시간 배양 후, 그들의 성장 속도가 느려집니다 2 ~ 3 시간 배양은 세포의 대부분이 완전히 프로세스를 성장 것을 보장한다. 여기에서 우리는 S2 세포에서 미세 소관을 따라 세포 기관 수송의 두 가지 대표적인 예를 보여 LysoTracker,...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

여기에서 우리는 초파리 S2 세포와 차 신경 세포 배양에서 미세 소관 따라화물 수송 공부를위한 상세한 프로토콜을 제시한다. 두 S2 프로세스와 신경 돌기는 세포 기관의 수송을위한 트랙 역할을 번들로 미세 소관 배열로 채워 구조입니다.

두 가지 전략은 일반적으로 라벨 세포 기관에 사용됩니다 문화에 직접 추가 형광 염료를 가진 세포 기관 타겟팅 순서 나 염색과 형광 단백질을 코딩하는 벡터의 형질 전환. 화물 라벨의 일반적인 예는 표 1에 나타내었다. 세포 이미징의 coverslips에 도금하기 전에 초파리 S2 세포의 과도 형질 또는 RNAi의 치료가 필요한 경우 서스펜션은 4,6,7,9,10에서 수행된다.

S2 세포 실험으로 신뢰성있는 결과를 얻기 위해서는 다음 사항에 유의하는 것이 중요하다 :

  1. 이미징을위한 최적의 밀도에서...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

감사의 글

우리는 이러한 프로토콜의 발전에 기여 Gelfand는 실험실의 구성원을 감사드립니다. 이 책에서보고 된 연구는 보너스 번호 BFI-2011-295 UDC에 아래 VIG에 보너스 번호 R01GM052111에서 건강의 국립 연구소의 일반 의료 과학 국립 연구소 바스크 정부 교육부, 대학 및 연구에 의해 지원되었다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
파우더 곤충 세포 배지 (Schneider ' s)시그마S9895
곤충 – Xpress 매체피셔BW12730Q
인슐린시그마I6634
페니실린연구 제품 국제P93000
스트렙토마이신연구 제품 국제S62000
테트라사이클린 염산염시그마T7660-5G
소 태아 혈청애틀랜타 생물학제S11150
Concanavalin ASigmaC2010
Cytochalasin DVWRIC15077105
LysoTracker Red DND-99분자 프로브L7528
100 µ m 세포 여과기Fisher Scientific22363549
25mm 원형 커버 유리VWR48380 080
Drosophila 바이알VWR89092-730
일치하는 마이크로튜브가 있는 일회용 펠릿 절굿공이Kimble Chase749520-0000

참고문헌

  1. Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 27, 353-365 (1972).
  2. Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence. 3, 606-611 (2008).
  3. Buster, D. W., Nye, J., Klebba, J. E., Rogers, G. C. Preparation of Drosophila S2 cells for light microscopy. J. Vis. Exp. (40), e1982(2010).
  4. Ling, S. C., Fahrner, P. S., Greenough, W. T., Gelfand, V. I. Transport of Drosophila fragile X mental retardation protein-containing ribonucleoprotein granules by kinesin-1 and cytoplasmic dynein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17428-17433 (2004).
  5. Kural, C., et al. Kinesin and dynein move a peroxisome in vivo: a tug-of-war or coordinated movement. Science. 308, 1469-1472 (2005).
  6. Kim, H., et al. Microtubule binding by dynactin is required for microtubule organization but not cargo transport. J. Cell. Biol. 176, 641-651 (2007).
  7. Ally, S., Larson, A. G., Barlan, K., Rice, S. E., Gelfand, V. I. Opposite-polarity motors activate one another to trigger cargo transport in live cells. J. Cell. Biol. 187, 1071-1082 (2009).
  8. Bensenor, L. B., Barlan, K., Rice, S. E., Fehon, R. G., Gelfand, V. I. Microtubule-mediated transport of the tumor-suppressor protein Merlin and its mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 7311-7316 (2010).
  9. Jolly, A. L., et al. Kinesin-1 heavy chain mediates microtubule sliding to drive changes in cell shape. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 12151-12156 (2010).
  10. Barlan, K., Lu, W., Gelfand, V. I. The microtubule-binding protein ensconsin is an essential cofactor of Kinesin-1. Curr. Biol. 23, 317-322 (2013).
  11. Lu, W., Fox, P., Lakonishok, M., Davidson, M. W., Gelfand, V. I. Initial Neurite Outgrowth in Drosophila Neurons Is Driven by Kinesin-Powered Microtubule Sliding. Curr. Biol. 23, 1018-1023 (2013).
  12. Pathak, D., Sepp, K. J., Hollenbeck, P. J. Evidence that myosin activity opposes microtubule-based axonal transport of mitochondria. J. Neurosci. 30, 8984-8992 (2010).
  13. Clark, I. E., et al. Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature. 441, 1162-1166 (2006).
  14. Gunawardena, S., et al. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40, 25-40 (2003).
  15. Koo, E. H., et al. Precursor of amyloid protein in Alzheimer disease undergoes fast anterograde axonal transport. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1561-1565 (1990).
  16. Stokin, G. B., Goldstein, L. S. Axonal transport and Alzheimer's disease. Annu. Rev. Biochem. 75, 607-627 (2006).
  17. Bilsland, L. G., et al. Deficits in axonal transport precede ALS symptoms in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 20523-20528 (2010).
  18. Lloyd, T. E., et al. The p150(Glued) CAP-Gly domain regulates initiation of retrograde transport at synaptic termini. Neuron. 74, 344-360 (2012).
  19. Moughamian, A. J., Holzbaur, E. L. Dynactin is required for transport initiation from the distal axon. Neuron. 74, 331-343 (2012).
  20. Lorenzo, D. N., et al. Spectrin mutations that cause spinocerebellar ataxia type 5 impair axonal transport and induce neurodegeneration in Drosophila. J. Cell. Biol. 189, 143-158 (2010).
  21. Robinow, S., White, K. The locus elav of Drosophila melanogaster is expressed in neurons at all developmental stages. Dev. Biol. 126, 294-303 (1988).
  22. Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
  23. Furst, A., Mahowald, A. P. Differentiation of primary embryonic neuroblasts in purified neural cell cultures from Drosophila. Dev. Biol. 109, 184-192 (1985).
  24. Salvaterra, P. M., Bournias-Vardiabasis, N., Nair, T., Hou, G., Lieu, C. In vitro neuronal differentiation of Drosophila embryo cells. J. Neurosci. 7, 10-22 (1987).
  25. Wiemer, E. A., Wenzel, T., Deerinck, T. J., Ellisman, M. H., Subramani, S. Visualization of the peroxisomal compartment in living mammalian cells: dynamic behavior and association with microtubules. J. Cell. Biol. 136, 71-80 (1997).
  26. Rizzuto, R., et al. A gene specifying subunit VIII of human cytochrome c oxidase is localized to chromosome 11 and is expressed in both muscle and non-muscle tissues. J. Biol. Chem. 264, 10595-10600 (1989).
  27. Poot, M., et al. Analysis of mitochondrial morphology and function with novel fixable fluorescent stains. J. Histochem. Cytochem. 44, 1363-1372 (1996).
  28. Haller, T., Dietl, P., Deetjen, P., Volkl, H. The lysosomal compartment as intracellular calcium store in MDCK cells: a possible involvement in InsP3-mediated Ca2+ release. Cell Calcium. 19, 157-165 (1996).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

더 많은 논문 탐색

초파리 S2 세포미세소관 모터액틴 탈중합라이브 이미징형광 마커타임랩스 이미징Con A 코팅사이토칼라신 D
교양있는 세포 기관 전송 초파리 셀 : S2 세포주 및 기본 뉴런.
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.