Organel Transport i dyrkede<em> Drosophila</em> Celler: S2 Cell Line og Primary neuroner.
Summary
Drosophila S2-celler og dyrkede neuroner er gode systemer til billeddannelse af motordreven organel transport in vivo. Her beskriver vi detaljerede protokoller til dyrkning både celletyper, deres billedbehandling og analyse af transport.
Abstract
Drosophila S2-celler belagt på et dækglas i tilstedeværelsen af actin-depolymerisering drug danne lange ugrenede processer fyldt med ensartet polariserede mikrotubuli. Organeller bevæge sig langs disse processer af mikrotubuli motorer. Nem vedligeholdelse, høj følsomhed til RNAi-medieret protein knock-down og effektiv procedure for at skabe stabile cellelinjer gøre Drosophila S2-celler en ideel model for at studere godstransport via direkte billedvisning. De opnåede resultater med S2-celler kan yderligere anvendes til en mere fysiologisk relevant system: axonal transport i ubearbejdet neuroner dyrket fra dissocierede Drosophila embryoner. Dyrkede neuroner vokse lange neuritter fyldt med bundtede mikrotubuli, meget ligner S2 processer. Ligesom i S2-celler, kan organeller i dyrkede neuroner visualiseres ved enten organel-specifik fluorescerende farvestoffer eller ved anvendelse af fluorescerende organel markører kodes af DNA injiceret i tidlige embryoner eller udtrykkes i transgenic fluer. Derfor kan organel transport let optages i neuroner dyrket på dækglas anvender levende billeddannelse. Her beskriver vi procedurer for dyrkning og visualisere godstransport i Drosophila S2-celler og primære neuroner. Vi mener, at disse protokoller gør begge systemer tilgængelige for laboratorier studerer godstransport.
Introduction
Drosophila S2-celler har vundet stigende popularitet til at studere mange cellulære processer. Disse celler blev oprindeligt stammer fra trypsinerede sene embryoner af OregonR Drosophila melanogaster og vedligeholde makrofaglignende funktioner 1.. Drosophila S2-celler har mange fordele frem for andre cellelinjer. De dyrkes ved 25 ° C uden CO 2, og kan afbildes i mange timer ved stuetemperatur uden behov for opvarmning eller gasudveksling. Endnu vigtigere er, Drosophila S2-celler er meget følsomme over for RNAi behandling giver høj effektivitet knockdown af proteiner af interesse. S2-celler er yderst transficerbare og kan vælges stabile cellelinier mindre end fire uger for at tillade stabil ektopisk ekspression af proteiner af interesse. S2-celler normalt vokse enten løst tilknyttet, men ikke spredes på en kolbe eller i suspension. De kan induceres til at spredes på dækglas belagt med en plante lectin concanavalin A (ConA). Periferien af de spredte celler er specielt tynd og derfor er ideel til levende celler mikroskopi. Detaljerede protokoller for S2-celler kultur, RNAi behandling levende lys billeddannelse og immunfarvning kan findes i litteraturen 2,3. Vores laboratorium har vedtaget S2-celler som et modelsystem til at studere mikrotubulus-baserede godstransport. Drosophila-S2-celler behandlet med et lægemiddel, som depolymeriserer eller skærer F-actin, såsom cytochalasin D (CytoD), vokser lange processer fyldt med ensartet polariserede mikrotubuli 4 -10, hvilket gør det til et ideelt system til at studere last bevægelse langs mikrotubuli arrays. Forskellige parametre for transport i disse processer (. Dvs. fremskrivning længder, hastigheder, retningsbestemmelse osv.) kan let måles ved hjælp af automatiserede partikel-tracking software, DiaTrack (Semasopht: http://www.microscopy.info/Organization/Details/4423; Dr . Pascal Vallotton: http://www.csiro.au/en/Organisation-Structure/Divisions/Mathematics-Informatics-and-Statistics/PascalVallotton.aspx # a4). Disse egenskaber gør S2-celler en tiltalende system til at studere godstransport langs mikrotubuli i vævsdyrkningsceller.
Pilotforsøg i S2-celler kan udvides til en fysiologisk vigtig model for transporterende studier i Drosophila primære neuroner. Svarende til S2-celler, neuroner dyrket fra dissocierede embryoner er permeabel for små molekyler, såsom farvestoffer og inhibitorer og høj opløsning til billeddannelse af organel transport kan udføres i neuroner ved stuetemperatur. Brug Drosophila med forskellige genetiske baggrunde, kan vi undersøge gen-funktion i ubearbejdet neuroner på knockout (genetiske tab af funktion mutationer), knockdown (dsRNA injektion eller udtryk) eller ektopisk udtryk (transgene fluer). Konkret betyder fragmentering af actin filamenter hjælp CytoD behandling ikke forhindre neuritudvækst, men i stedet de vokser hurtigere, og dermed kan vi studere mikrotubuli-dependent organel transport CytoD-behandlede neuroner uden indflydelse af actinfilamenter 11. Derfor primære neuronale kulturer kombinere fordelene ved vævsdyrkningsceller og flyve genetik, hvilket gør det en stor system til at studere godstransport i en fysiologisk relevant system, 10,12. Da flere familiær neurodegenerative sygdomme kan være forårsaget af eller associeret med transportenheder defekter (fx Parkinsons sygdom 13, Huntingtons sygdom 14. Alzheimers sygdom 15,16, Amyotrofisk Lateral Sclerose / ALS 17, HMN7B og Perry syndrom 18,19, og spinocerebellar ataksi typen 5/SCA5 20), kan primære neuronale kulturer være nyttige i analysen af virkningerne af specifikke mutationer forårsager disse sygdomme på mikrotubuli-afhængige transport.
Endelig er der vigtige egenskaber ved mikrotubuli-afhængige transport velbevaret mellem pattedyr og fluer, men <em> Drosophila genetisk og cellekultur er billigere og tidskrævende, der berettiger til anvendelse af dyrkede Drosophila celler til at studere vigtige aspekter af organel transport i normale og patologiske tilstande.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her præsenterer vi detaljerede protokoller for at studere mikrotubuli-afhængig godstransport i Drosophila S2-celler og primære neuron kultur. Både S2 processer og neurites er strukturer fyldt med bundtede mikrotubuli arrays, der tjener som spor til organel transport.
To strategier er typisk anvendt til at mærke organeller: transfektion af vektorer, der koder for et fluorescerende protein med en organel-targeting sekvens eller farvning med fluorescerende farvestoffer tilsat dire…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker medlemmerne af Gelfand lab, der har bidraget til udviklingen af disse protokoller. Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af National Institute of General Medical Science af National Institutes of Health under tildelingen nummer R01GM052111 til VIG og baskiske regering Department of Education, universiteter og forskning under tildeling nummer BFI-2011-295 til UDC.
Materials
| Powder Insect cell medium (Schneider’s) | Sigma | S9895 |
| Insect –Xpress medium | Fisher | BW12730Q |
| Insulin | Sigma | I6634 |
| Penicillin | Research Products International | P93000 |
| Streptomycin | Research Products International | S62000 |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | T7660-5G |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 |
| Concanavalin A | Sigma | C2010 |
| Cytochalasin D | VWR | IC15077105 |
| LysoTracker Red DND-99 | Molecular Probes | L7528 |
| 100 µm Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 |
| 25 mm Circle cover glass | VWR | 48380 080 |
| Drosophila Vials | VWR | 89092-730 |
| Disposable pellet pestles with matching microtubes | Kimble Chase | 749520-0000 |
References
- Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 27, 353-365 (1972).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence. 3, 606-611 (2008).
- Buster, D. W., Nye, J., Klebba, J. E., Rogers, G. C. Preparation of Drosophila S2 cells for light microscopy. J. Vis. Exp. (40), e1982 (2010).
- Ling, S. C., Fahrner, P. S., Greenough, W. T., Gelfand, V. I. Transport of Drosophila fragile X mental retardation protein-containing ribonucleoprotein granules by kinesin-1 and cytoplasmic dynein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17428-17433 (2004).
- Kural, C., et al. Kinesin and dynein move a peroxisome in vivo: a tug-of-war or coordinated movement. Science. 308, 1469-1472 (2005).
- Kim, H., et al. Microtubule binding by dynactin is required for microtubule organization but not cargo transport. J. Cell. Biol. 176, 641-651 (2007).
- Ally, S., Larson, A. G., Barlan, K., Rice, S. E., Gelfand, V. I. Opposite-polarity motors activate one another to trigger cargo transport in live cells. J. Cell. Biol. 187, 1071-1082 (2009).
- Bensenor, L. B., Barlan, K., Rice, S. E., Fehon, R. G., Gelfand, V. I. Microtubule-mediated transport of the tumor-suppressor protein Merlin and its mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 7311-7316 (2010).
- Jolly, A. L., et al. Kinesin-1 heavy chain mediates microtubule sliding to drive changes in cell shape. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 12151-12156 (2010).
- Barlan, K., Lu, W., Gelfand, V. I. The microtubule-binding protein ensconsin is an essential cofactor of Kinesin-1. Curr. Biol. 23, 317-322 (2013).
- Lu, W., Fox, P., Lakonishok, M., Davidson, M. W., Gelfand, V. I. Initial Neurite Outgrowth in Drosophila Neurons Is Driven by Kinesin-Powered Microtubule Sliding. Curr. Biol. 23, 1018-1023 (2013).
- Pathak, D., Sepp, K. J., Hollenbeck, P. J. Evidence that myosin activity opposes microtubule-based axonal transport of mitochondria. J. Neurosci. 30, 8984-8992 (2010).
- Clark, I. E., et al. Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature. 441, 1162-1166 (2006).
- Gunawardena, S., et al. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40, 25-40 (2003).
- Koo, E. H., et al. Precursor of amyloid protein in Alzheimer disease undergoes fast anterograde axonal transport. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1561-1565 (1990).
- Stokin, G. B., Goldstein, L. S. Axonal transport and Alzheimer’s disease. Annu. Rev. Biochem. 75, 607-627 (2006).
- Bilsland, L. G., et al. Deficits in axonal transport precede ALS symptoms in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 20523-20528 (2010).
- Lloyd, T. E., et al. The p150(Glued) CAP-Gly domain regulates initiation of retrograde transport at synaptic termini. Neuron. 74, 344-360 (2012).
- Moughamian, A. J., Holzbaur, E. L. Dynactin is required for transport initiation from the distal axon. Neuron. 74, 331-343 (2012).
- Lorenzo, D. N., et al. Spectrin mutations that cause spinocerebellar ataxia type 5 impair axonal transport and induce neurodegeneration in Drosophila. J. Cell. Biol. 189, 143-158 (2010).
- Robinow, S., White, K. The locus elav of Drosophila melanogaster is expressed in neurons at all developmental stages. Dev. Biol. 126, 294-303 (1988).
- Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
- Furst, A., Mahowald, A. P. Differentiation of primary embryonic neuroblasts in purified neural cell cultures from Drosophila. Dev. Biol. 109, 184-192 (1985).
- Salvaterra, P. M., Bournias-Vardiabasis, N., Nair, T., Hou, G., Lieu, C. In vitro neuronal differentiation of Drosophila embryo cells. J. Neurosci. 7, 10-22 (1987).
- Wiemer, E. A., Wenzel, T., Deerinck, T. J., Ellisman, M. H., Subramani, S. Visualization of the peroxisomal compartment in living mammalian cells: dynamic behavior and association with microtubules. J. Cell. Biol. 136, 71-80 (1997).
- Rizzuto, R., et al. A gene specifying subunit VIII of human cytochrome c oxidase is localized to chromosome 11 and is expressed in both muscle and non-muscle tissues. J. Biol. Chem. 264, 10595-10600 (1989).
- Poot, M., et al. Analysis of mitochondrial morphology and function with novel fixable fluorescent stains. J. Histochem. Cytochem. 44, 1363-1372 (1996).
- Haller, T., Dietl, P., Deetjen, P., Volkl, H. The lysosomal compartment as intracellular calcium store in MDCK cells: a possible involvement in InsP3-mediated Ca2+ release. Cell Calcium. 19, 157-165 (1996).
