Drosophila S2 клетки и культивируемые нейроны большие системы для визуализации с приводом от двигателя органелл транспорта в естественных условиях. Здесь мы опишем подробные протоколы для культивирования клеток обоих видов, их визуализации и анализа транспорта.
Drosophila S2 клетки высевали на покровное в присутствии любых актин-деполимеризации лекарственной формы длинных неразветвленных процессов, заполненных равномерно поляризованных микротрубочек. Органеллы двигаться вдоль этих процессов микротрубочек двигателей. Простота обслуживания, высокая чувствительность к РНК-интерференции-опосредованной белка нокдаун и эффективной процедуры для создания стабильных клеточных линий сделать дрозофилы S2 клетках идеальную модель системы для изучения Грузовой живого изображения. Результаты, полученные с S2 клетках может быть дополнительно применен к более физиологически соответствующие системы: аксонального транспорта в первичных нейронах, культивированных из диссоциированных эмбрионов Drosophila. Искусственный нейроны растут длинные нейриты наполненные комплекте микротрубочек, очень похожих на S2 процессов. Как и в S2 клетках, органеллы в культуре нейронов могут быть визуализированы либо органеллоспецифичными флуоресцентных красителей или с помощью флуоресцентных маркеров органелл, кодируемые ДНК вводят в ранних эмбрионов или выражается в трансгеннойМикросхема летит. Поэтому органелл транспорт может быть легко записаны в нейронах, культивируемых на покровные стекла с использованием живого изображения. Здесь мы опишем процедуры культивирования и визуализации грузовых перевозок в дрозофилы S2 клетках и первичных нейронов. Мы считаем, что эти протоколы сделать обе системы доступны для лабораторий, изучающих грузовых перевозок.
Drosophila S2 клетки приобрели большую популярность для изучения многих клеточных процессов. Эти клетки были первоначально получены из трипсинизировали конце эмбрионов стадии OregonR дрозофилы и поддерживать макрофагов-подобные функции 1. Дрозофилы S2 клетки имеют много преимуществ по сравнению с другими клеточными линиями. Они культивировали при 25 ° С без CO 2, и может быть отображены в течение многих часов при комнатной температуре без необходимости нагрева или газообмена. Что еще более важно, Drosophila S2 клетки очень чувствительны к лечению RNAi, позволяя высокой эффективности нокдаун интерес белков. S2 клетки очень transfectable и стабильные клеточные линии могут быть выбраны менее чем за четыре недели, чтобы позволить стабильную эктопическую экспрессию белков, представляющих интерес. S2 клетки обычно растут либо косвенное отношение, но не распространяются на колбе или в суспензии. Они могут быть вызваны для распространения на покровных предварительно покрытых с завода лектинов Конкаnavalin (КонА). Периферии распространенных клеток особенно тонкими и поэтому идеально подходит для живых клеток микроскопии. Подробные протоколы для S2 культуре клеток, лечения РНК-интерференции, живого изображения света и иммуноокрашивания можно найти в литературе 2,3. Наша лаборатория приняла S2 клетки в качестве модельной системы для изучения микротрубочек на основе грузовых перевозок. Дрозофилы S2 клетки, обработанные любой препарат, который depolymerizes или разрывает F-актин, например, цитохалазина D (CytoD), отращивать длинные процессы, заполненные равномерно поляризованных микротрубочек 4 -10, что делает его идеальной системой для изучения перемещения грузов по микротрубочек. Различные параметры транспорта в этих процессах (. Т.е. длины траектории, скорости, направленности и т.д.) может быть легко измерено с помощью автоматизированного программного обеспечения частиц отслеживания, DiaTrack (Semasopht: http://www.microscopy.info/Organization/Details/4423, д-р . Паскаль Валлотон: http://www.csiro.au/en/Organisation-Structure/Divisions/Mathematics-Informatics-and-Statistics/PascalVallotton.aspx # а4). Эти свойства делают S2 клетках привлекательный систему для изучения грузового транспорта вдоль микротрубочек в клетках тканевой культуры.
Пилотные эксперименты в S2 клетках может быть продлен до физиологически важных модели грузовых транспортных исследований в дрозофилы первичных нейронов. Как и в S2 клетках, нейроны культивировали от диссоциированных эмбрионов проницаемы для малых молекул, таких как красители и ингибиторы, и с высоким разрешением живой визуализации органелл транспорта может быть выполнена в нейронах при комнатной температуре. Использование дрозофилы с различными генетическим фоном, мы можем исследовать функции генов в первичных нейронов нокаутом (генетические с потерей функции мутации), нокдаун (дсРНК инъекции или выражение) или эктопическая экспрессия (трансгенные мухи). В частности, фрагментация нитей актина с использованием лечение CytoD не мешает рост аксонов, вместо этого они растут быстрее, и, таким образом мы можем изучать микротрубочек-зависимнт органелл транспорт в CytoD обработанных нейронов без влияния нитей актина 11. Таким образом, первичные нейронные культуры объединить преимущества тканевых культур клеток и летать генетику, что делает его отличным системой для изучения грузовых перевозок в физиологическом соответствующей системы 10,12. Поскольку несколько семейные нейродегенеративные заболевания могут быть вызваны или связаны с грузовых транспортных дефектов (например, болезнь Паркинсона 13, болезнь Хантингтона 14, болезнь Альцгеймера 15,16, боковой амиотрофический склероз / ALS 17, HMN7B и Перри синдром 18,19, и спиноцеребеллярной Тип атаксия 5/SCA5 20), первичных нейронов культур может быть полезным при анализе эффектов специфических мутаций, вызывающих эти заболевания на микротрубочек в зависимости от транспорта.
Наконец, важные свойства микротрубочек в зависимости от транспорта хорошо сохраняется между млекопитающих и мух, но <em> Дрозофилы генетической и клеточной культуры является менее дорогостоящим и трудоемким, оправдывая использование культивируемых клетках дрозофилы для изучения основные аспекты органелл транспорта в норме и при патологии.
Здесь мы представляем подробные протоколы для изучения микротрубочек в зависимости от грузовых перевозок в дрозофилы S2 клетках и первичной культуре нейронов. Оба процесса S2 и невриты являются структуры, заполненные комплекте микротрубочек массивов, которые служат треков для ор?…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим членов лаборатории Гельфанда которые внесли вклад в развитие этих протоколов. Исследования сообщили в настоящей публикации при поддержке Национального института Генеральной медицинских наук из Национального института здоровья в рамках премии числа R01GM052111 к VIG и Постановлением Правительства департамента Басков образования, университетов и исследований при награда числа BFI-2011-295, чтобы УДК.
Powder Insect cell medium (Schneider’s) | Sigma | S9895 |
Insect –Xpress medium | Fisher | BW12730Q |
Insulin | Sigma | I6634 |
Penicillin | Research Products International | P93000 |
Streptomycin | Research Products International | S62000 |
Tetracycline hydrochloride | Sigma | T7660-5G |
Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 |
Concanavalin A | Sigma | C2010 |
Cytochalasin D | VWR | IC15077105 |
LysoTracker Red DND-99 | Molecular Probes | L7528 |
100 µm Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 |
25 mm Circle cover glass | VWR | 48380 080 |
Drosophila Vials | VWR | 89092-730 |
Disposable pellet pestles with matching microtubes | Kimble Chase | 749520-0000 |