培養中の細胞小器官輸送<em>ショウジョウバエ</em>細胞：S2細胞ラインと一次ニューロン。
Summary
ショウジョウバエ S2細胞および培養されたニューロンは、インビボでの電動オルガネラ輸送のイメージングのための優れたシステムである。ここでは、両方の細胞型、それらの画像化および輸送の分析を培養するための詳細なプロトコルを記載している。
Abstract
ショウジョウバエ S2細胞は一様に分極微小管で満たされた任意のアクチン脱重合薬物形の長い分岐していないプロセスの存在下でカバーガラス上にプレー。細胞小器官は、微小管モーターによって、これらのプロセスに沿って移動する。メンテナンスが容易、安定な細胞株を作成するためのRNAiを介したタンパク質ノックダウンと効率的な手順に対する高い感受性は、ショウジョウバエ S2細胞のライブイメージングによる貨物輸送を研究するための理想的なモデルシステムを作る。解離したショウジョウバエ胚由来の初代培養ニューロンにおける軸索輸送：S2細胞で得られた結果は、さらにより生理学的に関連するシステムに適用することができる。培養されたニューロンは、S2のプロセスに非常によく似てバンドルされた微小管を充填し、長い神経突起を成長させる。 S2細胞中と同様に、培養神経細胞における細胞小器官は、初期胚に注入またはトランスジーンのいずれかで発現オルガネラ特異的蛍光色素によって、またはDNAによってコードされる細胞小器官の蛍光マーカーを用いて可視化することができるICハエ。従って、細胞小器官輸送が容易に生体イメージングを用いてガラスカバースリップ上で培養ニューロンにおいて記録することができる。ここでは、 ショウジョウバエ S2細胞および一次ニューロンで貨物輸送を培養し、可視化するための手順について説明します。私たちは、これらのプロトコルは、貨物輸送を研究するラボ用両方のシステムにアクセスできるようにと考えています。
Introduction
ショウジョウバエ S2細胞は多くの細胞プロセスを研究するための人気の高まりを得ています。これらの細胞は、もともとOregonR キイロショウジョウバエのトリプシン処理し、後期胚から得られ、1。 ショウジョウバエ S2細胞は他の細胞株に比べて多くの利点を提供するマクロファージ様な機能を維持した。それらは、CO 2なしで25℃で培養し、加熱またはガス交換を必要とせず、室温で長時間撮像することができる。より重要なことには、 ショウジョウバエ S2細胞は、目的のタンパク質の高効率ノックダウンを可能にするRNAi処理に非常に敏感である。 S2細胞は、高度にトランスフェクトされ、安定な細胞株は、目的のタンパク質の安定な異所性発現を可能にするために4週間未満に選択することができる。 S2細胞は、通常はどちらかに成長緩く付着したが、フラスコにまたは懸濁液中に広がっていない。それらは、植物レクチンコンカでプレコートしたカバースリップ上に広げるように誘導することができるnavalin A（ConAを）。スプレッド細胞の周囲は特に薄く、したがって、生細胞顕微鏡検査に最適です。 S2細胞培養のための詳細なプロトコルは、RNAi処理、生光イメージングおよび免疫染色は文献2,3に記載されています。私たちの研究室では、微小管ベースの貨物輸送を研究するためのモデル系としてS2細胞を採用しています。このようなサイトカラシンD（CytoD）として、F-アクチンの脱重合または切断する任意の薬物で処理されたショウジョウバエ S2細胞は、一様に分極微小管4で満たされた長い突起を成長さその微小管の配列に沿って貨物の動きを研究する理想的なシステムにする-10、。これらのプロセスにおける輸送の異なるパラメータ（。 すなわち軌道の長さ、速度、方向など ） を容易に自動化された粒子追跡ソフトウェアを、DiaTrack（Semasopht用いて測定することができます。http://www.microscopy.info/Organization/Details/4423;博士。パスカルロットン：http://www.csiro.au/en/Organisation-Structure/Divisions/Mathematics-Informatics-and-Statistics/PascalVallotton.aspx＃A4）。これらのプロパティは、S2細胞を組織培養細胞内の微小管に沿って貨物輸送を研究するための魅力的なシステムを作る。
S2細胞におけるパイロット実験は、 ショウジョウバエ一次ニューロンにおける貨物輸送研究の生理学的に重要なモデルに拡張することができる。 S2細胞と同様に、解離した胚から培養されたニューロンは、染料及び阻害剤のような小分子に対して透過性であり、細胞小器官輸送の高解像度のライブイメージングは、室温でのニューロンで行うことができる。異なる遺伝的背景を持つショウジョウバエを使って、我々はノックアウト（遺伝子の機能喪失変異が）によって一次ニューロンにおける遺伝子機能を調べることができ、ノックダウン（dsRNAを注入または式）または異所性発現（トランスジェニックハエ）。代わりに、彼らはより速く成長し、したがって、私たちは、微小管dependeを学ぶことができ、具体的には、CytoD処理を用いてアクチンフィラメントの断片化は、神経突起伸長を防ぐことはできませんアクチンフィラメント11の影響を受けずにCytoD処理したニューロンでの輸送をオルガネラNT。そのため、一次ニューロン培養は、生理学的に関連するシステム10,12に貨物輸送を研究するのに最適なシステムになり、これを組織培養細胞の利点を組み合わせると遺伝学を飛ぶ。いくつかの家族性の神経変性疾患は、に起因する、または貨物輸送の欠陥（ 例えば 、パーキンソン病13と関連付けることができたので、ハンチントン病14、アルツハイマー病15,16、筋萎縮性側索硬化症/ ALS 17、HMN7Bとペリー症候群18,19、および脊髄小脳失調タイプ5/SCA5 20）、初代神経培養は、微小管依存性輸送にこれらの疾患の原因となる特定の変異の効果の分析に役立ちます。
最後に、微小管依存性輸送の重要な特性はよく、哺乳類やハエの間で保存されているが、 <em>ショウジョウバエ遺伝的および細胞培養物は、正常および病的状態におけるオルガネラ輸送の重要な側面を研究するための培養されたショウジョウバエ細胞の使用を正当化する、より安価であり、時間がかかる。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、 ショウジョウバエ S2細胞および一次神経細胞培養で微小管依存貨物輸送を研究するための詳細なプロトコルを提示する。両方S2プロセスや神経突起は、細胞小器官の輸送のためのトラックとして機能バンドルされた微小管アレイで満たされた構造である。
2つの戦略は、一般的に細胞小器官を標識するために使用される：ベクターのトランスフェクショ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、これらのプロトコルの開発に貢献したゲルファントラボのメンバーに感謝。この刊行物で報告された研究は賞の数BFI-2011から295 UDCの下にVIGへの賞の数R01GM052111下の国立衛生研究所の総合医科学研究所がバスク政府教育省、大学や研究によってサポートされていました。
Materials
| Powder Insect cell medium (Schneider’s) | Sigma | S9895 |
| Insect –Xpress medium | Fisher | BW12730Q |
| Insulin | Sigma | I6634 |
| Penicillin | Research Products International | P93000 |
| Streptomycin | Research Products International | S62000 |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | T7660-5G |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 |
| Concanavalin A | Sigma | C2010 |
| Cytochalasin D | VWR | IC15077105 |
| LysoTracker Red DND-99 | Molecular Probes | L7528 |
| 100 µm Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 |
| 25 mm Circle cover glass | VWR | 48380 080 |
| Drosophila Vials | VWR | 89092-730 |
| Disposable pellet pestles with matching microtubes | Kimble Chase | 749520-0000 |
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